UVB誘導(dǎo)MEF細(xì)胞miR-365-465的表達(dá)及其信號通路的初步研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 太陽輻射中的紫外線根據(jù)波長可分為長波紫外線(UVA 320-400nm)、中波紫外線(UVB 280-320nm)和短波紫外線(UVC 100-280nm)。臭氧層能有效吸收全部的UVC和約95％的UVB,UVA則不能被吸收。雖然到達(dá)地面的UVB相對于UVA只占很小的比例,但由于皮膚中大多數(shù)的生物分子都是UVB輻射的吸收劑,如核酸、芳香族氨基酸等,因此,此波段的紫外線生物學(xué)效應(yīng)最強(qiáng),長期大劑量照射可引起皮

2、膚癌。
　　 作為腫瘤抑制基因的核轉(zhuǎn)錄因子,p53基因參與了細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)及血管發(fā)生等一系列生物過程,是迄今發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤關(guān)系最為密切的抑痛基因,幾乎所有的人類腫瘤中均存在p53信號通路的異常。UVB誘導(dǎo)的皮膚腫瘤的發(fā)生也是一個復(fù)雜的連續(xù)過程,包括一系列基因如原癌基因、抑癌基因的遺傳改變,其中,UVB誘導(dǎo)的腫痛抑制基因p53的突變被認(rèn)為是一個較早期的步驟。
　　 MicroRNA(miRNA)是一種非編

3、碼的內(nèi)源性小RNA,長約22個核苷酸,可以通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控,導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制,在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。在p53基因活化通路中,多種miRNA成為其活化后下調(diào)某些蛋白表達(dá)的重要中間分子,miRNA家族成員廣泛參與了p53基因信號通路的調(diào)控,如miR-34家族、miR-29家族、miR-192和miR-215等。是否還有其他的miRNA分子也受p53基因的

4、調(diào)控,或者調(diào)控p53信號通路的其他分子呢?
　　 在生長抑制的人成纖維細(xì)胞WI-38中,存在miR-365的明顯下調(diào),在對細(xì)胞增殖進(jìn)行負(fù)調(diào)控的信號通路中,發(fā)現(xiàn)其上游調(diào)節(jié)因子包括衰老相關(guān)的miRNA,而腫瘤抑制基因p53則是此通路的中心。我們前期的研究工作證實,UVB輻射能顯著改變NIH3T3細(xì)胞中miRNA的表達(dá)特性,多種miRNA在不同時間點出現(xiàn)高表達(dá),特別是miR-365在UVB照射后6h的表達(dá)升高近7倍,而miR-465在

5、每個時間點的表達(dá)都顯著下調(diào)。但與UVB誘導(dǎo)的miR-365/465表達(dá)變化相關(guān)的信號通路還未有報道。因此,進(jìn)一步探討UVB輻射對miR-365/465表達(dá)變化的影響以及腫瘤抑制基因p53可能在UVB誘導(dǎo)的miR-365/465表達(dá)變化中的作用,深入認(rèn)識miR-365/465的功能及其在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用,尋找其下游靶基因仍有待研究。
　　 資料和方法
　　 野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(p53+/+細(xì)胞)購自美國典型培

6、養(yǎng)物收藏所(American Type Culture Collection,ATCC),p53缺失小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(p53-/-細(xì)胞)由南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)系惠贈。我們用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)對p53+/+和p53-/-這兩利,細(xì)胞進(jìn)行了驗證；用實時熒光定量PCR方法(real-time quantitative PCR)檢測了UVB照射后p53+/+和p53-/-細(xì)胞中m

7、iR-365/465的表達(dá),miRNA的變化以三個復(fù)孔的Ct值均值通過ΔCt法進(jìn)行計算；利用miRBase、PicTar和TargetScan三個經(jīng)典靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫對miR-365/465的靶基因進(jìn)行預(yù)測,并用生物信息學(xué)方法對靶基因進(jìn)行了初步的基因功能分析。
　　 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示。熒光定量PCR細(xì)胞ΔCt值的比較采用2-△△Ct法計算,改變達(dá)到2倍以上為差

8、異有顯著意義。
　　 結(jié)果
　　 1 經(jīng)50J/m2UVB照射后,miR-365的表達(dá)下調(diào),p53+/+細(xì)胞在照后4h、6h和24h的表達(dá)較對照組分別降低了2.5倍、2倍和2倍,差異有顯著性；p53-/-細(xì)胞在照后2h、4h和6h的表達(dá)較對照組分別降低了2.5倍、3倍和2倍,改變具有顯著意義。
　　 2 經(jīng)50J/m2UVB照射后,p53+/+細(xì)胞中miR-465的表達(dá)下調(diào),在照后各時間點其降低都超過2倍；p53

9、-/-細(xì)胞中miR-465的表達(dá)上調(diào),在照后2h、4h、6h和12h升高均超過2倍,差異有顯著意義。
　　 3 經(jīng)50J/m2UVB照射后,在對應(yīng)的時間點,p53-/-細(xì)胞中miR-365的表達(dá)低于p53+/+細(xì)胞,其中對應(yīng)的2h和4h的差別都超過了2倍；p53-/-細(xì)胞巾miR-465的表達(dá)顯著高于p53+/+細(xì)胞,差異均具有顯著意義。
　　 4 利用miRBase、Pictar和TargetScan三個經(jīng)典靶基因預(yù)測

10、數(shù)據(jù)庫對miR-365/465的靶基因進(jìn)行預(yù)測,3個數(shù)據(jù)庫預(yù)測的miR-365的靶基因取交集后得到32個靶基因,該32個靶基因的生物學(xué)功能主要集中在細(xì)胞增殖/分化、轉(zhuǎn)錄因子活性、細(xì)胞增殖的負(fù)向調(diào)控、細(xì)胞增殖的正向調(diào)控和氧化應(yīng)激反應(yīng)等方面；miR-465的靶基因3個數(shù)據(jù)庫取交集后得到29個靶基因,該29個靶基因的生物學(xué)功能主要包括細(xì)胞增殖/分化、轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化、受體信號蛋白活性以及GTP酶ARF激活物活性等。
　　

11、結(jié)論
　　 1 miR-365在UVB照射后表達(dá)降低,且具有時間依賴性；p53基因?qū)VB誘導(dǎo)的miR-365的表達(dá)具有正向調(diào)節(jié)作用,此作用在UVB照射后的早期(4h)最為明顯。
　　 2 miR-465在LJVB照射后的p53+/+細(xì)胞中的表達(dá)降低,在UVB照射后的p53-/-細(xì)胞中表達(dá)升高；p53基因?qū)VB照射后miR-465的表達(dá)具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用,且此調(diào)節(jié)作用較持久(達(dá)24h)。
　　 3 生物信息學(xué)的分