MAPK信號通路在氯化鎘誘導星形膠質(zhì)細胞凋亡中作用的初步研究.pdf

1、目的：①體外分離、培養(yǎng)及鑒定星形膠質(zhì)細胞；②研究氯化鎘對體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞凋亡發(fā)生的影響；③探討 MAPK信號通路是否參與了鎘誘導星形膠質(zhì)細胞的凋亡過程。
　　方法：①取新生24h內(nèi)SD大鼠大腦皮質(zhì)組織，采用恒溫搖床的方法純化星形膠質(zhì)細胞，體外培養(yǎng)傳至第三代，采用GFAP免疫細胞化學法鑒定星形膠質(zhì)細胞;②以0、2.5、5、10、20、40μmol/L染毒12h、24h，MTT法測定氯化鎘對星形膠質(zhì)細胞的毒性作用；③以0、2.5

2、、5、10、20、40μmol/L氯化鎘染毒12h，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化；④以20μmol/L氯化鎘染毒12h（對照組為0μmol/L氯化鎘的無血清DMEM作用12h），透射電鏡觀察星形膠質(zhì)細胞超微結(jié)構(gòu)變化；⑤以0、2.5、5、10、20μmol/L氯化鎘染毒12h，Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率；⑥以0、2.5、5、10、20μmol/L氯化鎘染毒12h,Western blot方法檢測ER

3、K磷酸化水平和ERK水平。
　　結(jié)果：①純化后的星形膠質(zhì)細胞，胞體大而扁，胞突豐富，初級胞突較多且長.細胞傳兩代后，經(jīng)GFAP免疫細胞化學染色，陽性細胞胞漿和突起呈棕黃色，星形膠質(zhì)細胞純度達95％，可用于后續(xù)實驗。②MTT法檢測結(jié)果顯示氯化鎘對星形膠質(zhì)細胞有一定的細胞毒性，鎘濃度為2.5μmol/L時在各時間點（12h、24h)均未引起細胞存活率下降；細胞存活率在12h、24h時間點隨著染毒劑量（5~40μmol/L）的逐漸增加而

4、下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01)。③倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化：鎘濃度為（0~5μmol/L）時，星形膠質(zhì)細胞形態(tài)并未見到明顯改變；10μmol/L時細胞突起變細變短，細胞間隙增大，細胞無脫落現(xiàn)象；20μmol/L時，胞體收縮，突起消失或成毛刺狀，細胞稀疏，部分細胞收縮成球形，貼壁能力下降；40μmol/L時，細胞收縮成球形，大部分細胞脫壁，漂浮于細胞培養(yǎng)液中；④透射電鏡觀察結(jié)果：對照組：胞核形態(tài)規(guī)則，各細胞器形態(tài)

5、正常；20μmol/L染毒12h:胞核形態(tài)不規(guī)則，核膜內(nèi)陷，線粒體呈現(xiàn)空泡樣變。⑤Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率結(jié)果：0、2.5、5、10、20μmol/L氯化鎘作用12h,細胞凋亡率分別為2.47％，2.71％，4.74％，17.78％，30.51％，(5~20μmol/L)鎘濃度時細胞凋亡率隨著染毒劑量的增加而增加,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01)。⑥Western blot檢測結(jié)果：(1