MAPK-COX路徑在GnRH調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞PGE2表達(dá)中的作用.pdf

1、動(dòng)物的繁殖機(jī)能主要是受促性腺激素釋放激素神經(jīng)元（gonadotropin-releasing hormone neurons,GnRH neurons）調(diào)控，GnRH神經(jīng)元合成分泌的GnRH以脈沖的方式從正中隆起釋放進(jìn)入垂體門脈系統(tǒng)，到達(dá)腺垂體并特異性地與促性腺細(xì)胞上的受體結(jié)合，刺激腺垂體合成和分泌LH、FSH，最終調(diào)節(jié)動(dòng)物的生殖行為。星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes,AST）是一種特殊的膠質(zhì)細(xì)胞，連續(xù)地分布于整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，執(zhí)行著

2、復(fù)雜的功能。近年來，隨著學(xué)者們對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的深入研究發(fā)現(xiàn)，除了GnRH神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的膠質(zhì)因子PGE2能夠通過調(diào)節(jié)GnRH神經(jīng)元的活性和分泌來間接調(diào)節(jié)動(dòng)物的繁殖。然而，GnRH神經(jīng)元分泌的GnRH能否反饋調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞仍沒有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用體外培養(yǎng)的大鼠下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞，探究GnRH對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌PGE2的調(diào)控機(jī)制。
　　其主要目標(biāo)為：
　?。?）探究星形膠質(zhì)細(xì)胞上是否存在GnRHR；
　?。?）在

3、體外條件下，GnRH是否影響培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中PGE2的表達(dá)；
　?。?）COX在GnRH調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌PGE2中的作用；
　?。?）MAPK信號(hào)通路是否參與GnRH對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞PGE2表達(dá)的調(diào)節(jié)。為了有效研究GnRH對(duì)體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞PGE2表達(dá)的影響，研究如下：
　　（1）實(shí)驗(yàn)選取1–3日齡的SD新生大鼠，分離下丘腦進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)，并多次純化達(dá)到純化率為99％以上的星形膠質(zhì)細(xì)胞，為后續(xù)研究提供了大量

4、高純度、符合要求的細(xì)胞。
　　（2）為了探究星形膠質(zhì)細(xì)胞上是否存在GnRHR，實(shí)驗(yàn)利用免疫熒光、基因測序及Western Blot方法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞上是否存在GnRHR，結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞上存在GnRHR，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　?。?）為了探究GnRH對(duì)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中PGE2表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)選取10-12 mol/L、10-10 mol/L、10-8 mol/L、10-6 mol/L的GnRH刺激體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)

5、細(xì)胞，分別在1 h、6 h、12h、24 h、48 h通過ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中PGE2的表達(dá)量。結(jié)果顯示，12 h時(shí)10-10 mol/L GnRH處理組與對(duì)照組相比PGE2的表達(dá)量升高，且差異顯著（P<0.05）；10-8 mol/L和10-6 mol/L的GnRH處理組與對(duì)照組相比PGE2的表達(dá)量減少，且差異顯著（P<0.05）。
　?。?）為了探究COX在GnRH調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌PGE2中的作用，實(shí)驗(yàn)選取10-10

6、 mol/L GnRH刺激細(xì)胞，通過熒光定量PCR、ELISA和 WesternBlot檢測在1 h、6 h、12 h、24 h、48 h時(shí)COX-1和COX-2的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，COX-1 mRNA的表達(dá)量在12 h時(shí)增加，COX-2 mRNA的表達(dá)量在6 h和12 h時(shí)顯著增加，與COX-1相比上調(diào)量更大；通過ELISA和Western Blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12 h后COX-1和COX-2的表達(dá)量均上調(diào)，且CO

7、X-2比 COX-1上調(diào)幅度更大，表明COX-2與COX-1相比起更主要的作用。
　　為了驗(yàn)證GnRH刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞后是否通過上調(diào)COX-1和COX-2而引起PGE2的表達(dá)升高，分別用50 nmol/L SC-560和3μmol/L NS-398預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后，通過ELISA檢測上清中PGE2含量。結(jié)果顯示，GnRH+SC-560組和GnRH+NS-398組對(duì)GnRH誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的PGE2均有抑制作用，而且NS-3

8、98對(duì)細(xì)胞分泌PGE2的抑制作用更強(qiáng)。表明COX-1和COX-2對(duì)GnRH誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的PGE2均有影響，而且COX-2起更主要的作用。
　?。?）為了研究p38、JNK、ERK三條經(jīng)典的MAPK信號(hào)通路在GnRH調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌PGE2中的作用，實(shí)驗(yàn)選取20μmol/L p38抑制劑SB203580、10μmol/L JNK抑制劑 SP600125、10μmol/LERK抑制劑U0126預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后分別加入1

9、0-10 mol/L GnRH預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞12 h，通過ELISA檢測上清中PGE2的含量。結(jié)果顯示，三種抑制劑均能夠抑制GnRH上調(diào)的PGE2，且U0126的抑制效果最明顯，表明p38、JNK、ERK信號(hào)通路對(duì)GnRH誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌PGE2的過程具調(diào)控作用，其中ERK信號(hào)通路對(duì)其調(diào)控作用最明顯。
　　MAPK通路抑制劑處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后，通過熒光定量PCR和Western Blot檢測COX-1和COX-2的表達(dá)水平

10、。結(jié)果顯示，SB203580和U0126能夠下調(diào)COX-1的mRNA和蛋白的表達(dá)，SP600125對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞COX-1無影響；SB203580、SP600125和U0126處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后均能顯著下調(diào)COX-2的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，其中U0126的抑制效果最明顯。該結(jié)果結(jié)合上述PGE2的表達(dá)變化表明，GnRH通過p38/ERK-COX-1和p38/JNK/ERK-COX-2信號(hào)通路促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞PGE2的產(chǎn)生，且p38/J

11、NK/ERK-COX-2途徑在產(chǎn)生PGE2的過程中起更重要的作用。
　　綜上所述，該實(shí)驗(yàn)可以得到以下結(jié)論：
　?。?）體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠表達(dá)GnRHR，為研究GnRH調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能奠定了形態(tài)學(xué)依據(jù)。
　?。?）GnRH影響星形膠質(zhì)細(xì)胞PGE2的表達(dá)，較高濃度（10-8 mol/L、10-6 mol/L）時(shí)抑制細(xì)胞PGE2的產(chǎn)生，較低濃度（10-10 mol/L）時(shí)對(duì)PGE2的表達(dá)具顯著促進(jìn)作用。