糖皮質(zhì)激素對星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的調(diào)控機制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)是由腎上腺皮質(zhì)合成和分泌的應(yīng)激激素,其濃度受下丘腦-垂體-腎上腺(Hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis,HPA軸)軸的調(diào)控。正常生理狀態(tài)下,糖皮質(zhì)激素對維持機體神經(jīng)系統(tǒng)的正常生長發(fā)育以及生理和應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定都極為重要。糖皮質(zhì)激素作為很強的免疫抑制劑參與體內(nèi)多種代謝過程,調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。研究證實,應(yīng)激反應(yīng)時腎上腺糖皮質(zhì)激素過度分

2、泌與生殖內(nèi)分泌疾病密切相關(guān),糖皮質(zhì)激素能在下丘腦水平擾亂GnRH神經(jīng)元的正常生理活動,從而抑制其生殖內(nèi)分泌功能。GC能夠通過糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor, GR)介導(dǎo)直接作用于促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)神經(jīng)元,從而影響GnRH神經(jīng)元的正常生理活動。下丘腦GnRH神經(jīng)元上存在GR,同時,應(yīng)激狀態(tài)下的糖皮質(zhì)激素對星形膠質(zhì)細(xì)胞會產(chǎn)生一定影響。星

3、形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要組成部分,近年來的研究發(fā)現(xiàn),星形膠質(zhì)細(xì)胞除了參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和神經(jīng)退行性疾病以及具有巨噬細(xì)胞的功能以外,在調(diào)控生殖方面也具有重要作用。研究表明,下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)、轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor-alpha,TGFβ)等活性因子,與GnRH神經(jīng)元上相應(yīng)的受體結(jié)合,促進GnRH的合成和分泌,控制生

4、殖活動。另外,下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞還能通過黏合分子和GnRH神經(jīng)元結(jié)合,完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo),促使GnRH神經(jīng)元分泌GnRH,從而調(diào)控生殖活動。但是星形膠質(zhì)細(xì)胞能否直接分泌GnRH來控制生殖活動,還未見報道。
  本實驗采用體外培養(yǎng)的大鼠下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞,探究糖皮質(zhì)激素對星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的調(diào)控機制。因此,需要獲得較純的下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞。實驗采用重慶市中藥研究所提供的1~—3日齡的SD新生大鼠,經(jīng)過原代細(xì)胞的分離培養(yǎng),在經(jīng)過多次純

5、化和傳代培養(yǎng)獲得純化率達(dá)99%以上的星形膠質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)過以上方法所得的星形膠質(zhì)細(xì)胞可為體外研究提供符合要求的細(xì)胞。
  本實驗采用體外培養(yǎng)的符合要求的星形膠質(zhì)細(xì)胞,通過免疫熒光,熒光定量PCR,GnRH ELISA試劑盒檢驗星形膠質(zhì)細(xì)胞是否分泌GnRH,結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌GnRH。
  為了檢驗GC對星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte,AST)表達(dá)GnRH的影響,本實驗通過采用10-6mol/L,10-7mol/L,1

6、0-8mol/L的GC刺激培養(yǎng)的AST,分別檢測10min、20min、30min、40min時AST GnRH水平,選出最佳時間和濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用10-8mol/L的GC刺激培養(yǎng)的AST,在30min時GnRH的表達(dá)量與對照組相比顯著升高(P<0.05),該實驗濃度和時間為最佳實驗濃度和時間。
  為了檢驗GC對AST GR的影響,本實驗通過采用10-6mol/L,10-7mol/L,10-8mol/L的GC刺激培養(yǎng)的AST,分

7、別檢測10min、20min、30min、40min時AST糖皮質(zhì)激素受體(GR)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)10-8mol/L的GC刺激培養(yǎng)的AST,在40min時AST GR表達(dá)量較其他實驗組顯著升高(P<0.05)。
  為了研究GC對星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的調(diào)節(jié)機制。本實驗采用10-8mol/L的牛血清白蛋白偶聯(lián)的糖皮質(zhì)激素(BSA-GC),10-6mol/L的糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486,10-8mol/L GC刺激AST,在30

8、min時檢測GnRH的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)RU486+GC組、GC組和GC+BSA-GC組AST GnRH較對照組顯著升高(P<0.05),證明短時間內(nèi)GC刺激AST分泌GnRH是通過非基因組效應(yīng)作用。
  為了了解GC作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,實驗用培養(yǎng)的AST,分別加10μM p38抑制劑SB203580、10μM ERK-1/-2抑制劑U0126、10μM JNK抑制劑SP600125。GC組加0μM SB203580、U0126和SP

9、600125,繼續(xù)培養(yǎng)30min后,分別加入10-8mol/L的GC,在10min、20min、30min、40min時測定AST GnRH水平。對照組加入等體積的無水乙醇,在10min、20min、30min、40min時測定AST GnRH水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SB203580+GC組和U0126+GC組AST GnRH表達(dá)水平較對照組顯著下降(P<0.05),SP600125+GC組AST GnRH表達(dá)水平變化不明顯(P>0.05)。證明

10、GC可以通過p38MAPK、ERK-1/-2MAPK轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑促進AST GnRH的表達(dá)。
  為了進一步探索GC作用的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否是PKC-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,實驗用培養(yǎng)的AST,加入1μM pkc抑制物星形孢菌素,繼續(xù)培養(yǎng)30min后,分別加入10-8mol/L的GC,在10min、20min、30min、40min時p38、ERK-1/-2、的磷酸化情況;在10min、20min、30min、40min時測定AS

11、T GnRH水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入PKC抑制劑+GC組AST GnRH的分泌較對照組明顯降低(P<0.05),證明GC作用的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游信號途徑和PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。
  綜上所述,該實驗可以得到以下結(jié)論:
  1、體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)糖皮質(zhì)激素受體,為研究糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能奠定了形態(tài)學(xué)依據(jù)。
  2、首次發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌GnRH,這為星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控生殖提供了重要的生理學(xué)依據(jù)。

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