硫酸化可德蘭多糖的制備、體外免疫調(diào)節(jié)、抗乙肝病毒感染活性及體內(nèi)用作乙肝疫苗佐劑研究.pdf

1、研究目的：
　　乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染可以造成急慢性肝臟疾病，如病毒性肝炎、肝硬化及肝癌等，是危害人類(lèi)健康的主要病因。我國(guó)HBV攜帶者約占全國(guó)總?cè)丝诘?0％，是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)。目前臨床使用抗HBV感染的典型藥物有拉米夫定和α-干擾素，但是存在容易誘發(fā)病毒耐藥突變以及副作用較多的問(wèn)題，限制了療效的發(fā)揮。HBV感染能夠破壞機(jī)體免疫平衡，導(dǎo)致機(jī)體抗病毒免疫功能低下或紊亂，因此，抑制HBV感染需要激活

2、機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答。給易感人群接種乙肝疫苗是預(yù)防HBV感染的有效手段，但是仍有5％-10％的人接種后抗體水平很低或者無(wú)應(yīng)答。鋁佐劑是目前唯一可以用于乙肝疫苗的佐劑，雖然較安全，但是因其不能引起機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答，使疫苗在預(yù)防和治療HBV感染方面存在一定的不足，因而研制新型乙肝疫苗佐劑尤為重要。
　　可德蘭多糖（curdlan）是由產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）發(fā)酵產(chǎn)生的一種胞外多糖，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、

3、抗凝血等活性，因其安全無(wú)毒且加熱可成凝膠，被FDA批準(zhǔn)用于食品工業(yè)。研究發(fā)現(xiàn)，curdlan硫酸化產(chǎn)物—硫酸化可德蘭(curdlan sulfate)具有良好的抗HIV活性，并已對(duì)其開(kāi)展Ⅱ期臨床試驗(yàn)。鑒于curdlan和curdlan sulfate二者良好的免疫調(diào)節(jié)及抗病毒活性，我們期望通過(guò)本課題研究能夠得到一種具有抗病毒感染作用的免疫調(diào)節(jié)劑，能夠在免疫治療方面發(fā)揮抗HBV感染的作用，同時(shí)還能增強(qiáng)重組乙肝表面抗原(hepatitis

4、B surface antigen，HBsAg)的免疫原性，改善疫苗在預(yù)防和治療HBV感染方面的應(yīng)用。
　　通過(guò)研究curdlan sulfate對(duì)小鼠免疫相關(guān)細(xì)胞的影響，考察其體外免疫調(diào)節(jié)活性，采用表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)研究其結(jié)合的受體;利用HepG2.2.15細(xì)胞上清液濃縮得到的HBV感染HepG2及HepaRG細(xì)胞，研究curdlan sulfate是否可以干擾病毒感

5、染細(xì)胞的過(guò)程，并用SPR技術(shù)研究多糖與重組HBsAg的結(jié)合情況;最后，將curdlan sulfate與重組HBsAg聯(lián)合注射BALB/c小鼠，研究其能否增強(qiáng)疫苗的免疫原性，提高產(chǎn)生的抗體水平。本課題研究將為curdlan sulfate開(kāi)發(fā)成為一種新型抗HBV的免疫預(yù)防及治療劑提供重要的依據(jù)和基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　1、Curdlan sulfate的制備及結(jié)構(gòu)表征
　　首先我們采用DMSO為溶劑、SO3-吡啶為

6、硫酸化試劑，對(duì)curdlan進(jìn)行修飾。通過(guò)控制反應(yīng)溫度，制備出四種curdlan sulfates。采用紅外光譜分析技術(shù)鑒定所制備樣品結(jié)構(gòu)，凝膠滲透色譜-多角度激光散射(GPC-MALLS)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定重均分子量((M)w)，元素分析儀測(cè)定硫(S)含量。
　　2、Curdlan sulfate體外免疫調(diào)節(jié)活性及機(jī)制的研究
　　分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，采用MTT法測(cè)定curdlan sulfate對(duì)其增殖的影響。采用小鼠RAW26

7、4.7細(xì)胞系，研究curdlan sulfate對(duì)巨噬細(xì)胞活化的作用，包括:用細(xì)胞吞噬中性紅和FITC-dextran實(shí)驗(yàn)來(lái)分析其對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響;Griess試劑法測(cè)定RAW264.7細(xì)胞經(jīng)curdlan sulfate作用后產(chǎn)生NO的水平;ELISA試劑盒測(cè)定curdlan sulfate對(duì)RAW264.7分泌IL-6、IL-1β及TNF-α細(xì)胞因子的影響;iNOS、IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平采用熒光定量

8、PCR(FQ-PCR)進(jìn)行分析。分離并培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDCs)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)curdlan sulfate對(duì)BMDCs表面成熟標(biāo)志分子表達(dá)的影響。機(jī)制研究采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)以及NF-κB的活化情況，并運(yùn)用SPR技術(shù)分析curdlan sulfates與小鼠重組dectin-1的結(jié)合情況。
　　3、Curdlan sulf

9、ate體外抗HBV感染活性及機(jī)制的研究
　　采用PEG8000對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清液進(jìn)行濃縮得到HBV，用其感染HepG2及HepaRG細(xì)胞。采用FQ-PCR測(cè)定受感染細(xì)胞中HBVDNA的含量來(lái)考察curdlan sulfate對(duì)HBV黏附及入胞過(guò)程的影響;用HBsAg及HBeAg ELISA試劑盒檢測(cè)受感染細(xì)胞培養(yǎng)第7d的細(xì)胞上清中HBsAg及HBeAg的含量，來(lái)考察curdlan sulfate對(duì)HBV感染細(xì)胞的影響

10、;采用氯酸鈉及硫酸乙酰肝素酶（HPA）處理HepG2及HepaRG細(xì)胞，用FQ-PCR檢測(cè)HBV感染細(xì)胞的情況，并進(jìn)一步用SPR技術(shù)分析curdlan sulfates與重組HBsAg的結(jié)合情況，探討硫酸根在curdlan sulfate與HBsAg結(jié)合中的作用，并進(jìn)一步分析其作用機(jī)制。
　　4、Curdlan sulfate體內(nèi)用作乙肝疫苗佐劑的研究
　　Curdlan sulfate與重組HBsAg聯(lián)合免疫BALB/c小

11、鼠，于第0、14、28d共接種3次，第35d取小鼠脾淋巴細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞巨噬細(xì)胞募集和樹(shù)突狀細(xì)胞成熟、CD4+、CD8+分群以及CD4活化情況;取小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)并用HBsAg再刺激，測(cè)定其增殖能力以及分泌IFN-γIL-17A、IL-4、IL-10的水平;流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法分析小鼠脾淋巴細(xì)胞中Th1、Th2及Th17類(lèi)細(xì)胞因子的胞內(nèi)表達(dá)情況。另外，在每次免疫后7d收集小鼠血清，用anti-HBs ELIS

12、A試劑盒測(cè)定血清中抗體的含量，并用間接ELISA方法測(cè)定anti-HBs免疫球蛋白亞型IgG1、IgG2a的含量，分析小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類(lèi)型。
　　研究結(jié)果：
　　1、Curdlan sulfate的制備及結(jié)構(gòu)表征
　　通過(guò)控制反應(yīng)條件，共制備了四種不同分子量及S含量的curdlan sulfates，分別命名為CS1、CS2、CS3及CSⅢ。紅外光譜檢測(cè)結(jié)果顯示，curdlan sulfates在curdlan原有特

13、征吸收峰基礎(chǔ)上，在1258cm-1及816cm-1附近處出現(xiàn)了不對(duì)稱(chēng)S=O的伸縮振動(dòng)峰及對(duì)稱(chēng)C-O-S的伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明curdlan已被成功硫酸化修飾。CS1、CS2、CS3和CSⅢ的(M)w經(jīng)GPC-MALLS測(cè)定為25.87kDa、87.03kDa、171.9kDa和62.54kDa，S含量分別為（4.806±0.30）％、（6.288±0.03）％、（9.340±0.16）％和(7.312±0.11)％。由于CS3含有最高的S含

14、量，下面的活性檢測(cè)均采用CS3樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2、CS3體外免疫調(diào)節(jié)活性與MAPKs途徑有關(guān)
　　CS3促進(jìn)小鼠細(xì)胞脾淋巴細(xì)胞增殖效果顯著，在400μg/mL時(shí)增殖率達(dá)到85.87％，但對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯作用。CS3能增強(qiáng)RAW264.7吞噬中性紅及FITC-dextran的能力，顯著提高細(xì)胞產(chǎn)生NO、IL-6、IL-1±及TNF-α的水平，而且對(duì)細(xì)胞中iNOS、IL-6、IL-1±和TNF-αmRNA

15、的水平也有一定的提高，并呈劑量依賴(lài)性。另外，CS3可促進(jìn)BMDCs上調(diào)表達(dá)MHCII、CD11c、CD40、CD80、CD86分子，產(chǎn)生IL-12和IL-6，刺激細(xì)胞成熟。
　　Western blot結(jié)果顯示CS3可以通過(guò)促進(jìn)MAPKs途徑中Erk1/2和SAPK/JNK的磷酸化來(lái)傳遞信號(hào)，活化NF-κB，提高iNOS的表達(dá)。SPR技術(shù)表明curdlan sulfates可以與curdlan已知受體dectin-1結(jié)合，說(shuō)明cu

16、rdlan經(jīng)硫酸化修飾后主要受體并未改變。
　　3、CS3可以抑制HBV感染的黏附過(guò)程
　　FQ-PCR結(jié)果顯示，CS3可以抑制HBV與HepG2及HepaRG細(xì)胞的黏附，500μg/mL時(shí)的抑制率為分別52.06％、50.43％;HBV感染細(xì)胞后上清中HBsAg及HBeAg的測(cè)定結(jié)果表明，CS3可以抑制HBV對(duì)細(xì)胞的感染。CS3對(duì)黏附過(guò)程的抑制率遠(yuǎn)高于其對(duì)HBV感染細(xì)胞的抑制率，說(shuō)明CS3抗HBV感染的作用階段主要是干擾病

17、毒黏附入胞過(guò)程，而不是干擾病毒DNA復(fù)制等過(guò)程。
　　氯酸鈉和HPA作用的細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)硫酸乙酰肝素(HS)，用HBV感染分別經(jīng)氯酸鈉和HPA處理后的HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)病毒感染水平分別降低為陰性對(duì)照的（11.44±2.30）％和（57.17±0.79）％;感染經(jīng)二者處理后的HepaRG細(xì)胞，感染率分別降低為陰性對(duì)照的（9.86±2.29）％和（49.70±16.07）％。SPR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)curdlan sulfates可以

18、與重組HBsAg結(jié)合，并且硫酸根含量越高，親和力越強(qiáng)，提示CS3可能與HBV包膜蛋白結(jié)合，干擾HBV入胞。
　　4、CS3可以增強(qiáng)重組HBsAg免疫原性
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)3次免疫接種后的小鼠脾淋巴細(xì)胞結(jié)果表明，CS3聯(lián)合重組HBsAg免疫小鼠，可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞在脾臟中的募集，F(xiàn)4/80陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，占脾淋巴細(xì)胞總數(shù)的（34.27±3.47）％，明顯高于商品HB疫苗(HBvaccine)組（**p＜0.01）;同時(shí)可以刺

19、激樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，使細(xì)胞高表達(dá)MHCII、CD11c、CD40和CD86分子;CD4+及CD8+T細(xì)胞亞群在脾淋巴細(xì)胞中的比例明顯升高，與HB vaccine相比有顯著性差異（*p＜0.05），且CD4+CD69+細(xì)胞數(shù)與單獨(dú)注射HBsAg相比有顯著性增加;分離小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行HBsAg體外再刺激，發(fā)現(xiàn)經(jīng)CS3作用的小鼠脾細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，分泌Th1類(lèi)型細(xì)胞因子IFN-γ的量明顯高于HB vaccine組（**p＜0.01），CS3

20、在高劑量時(shí)可以促進(jìn)Th2類(lèi)型細(xì)胞因子IL-4和IL-10的產(chǎn)生，但在低、中劑量時(shí)則作用不明顯甚至有一定的抑制作用，而對(duì)Th17類(lèi)細(xì)胞因子IL-17A則沒(méi)有明顯作用;采用流式細(xì)胞術(shù)分析胞內(nèi)Th1及Th2類(lèi)細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)情況與細(xì)胞上清中測(cè)定結(jié)果一致。
　　小鼠血清中anti-HBs檢測(cè)結(jié)果顯示，CS3可以明顯提高HBsAg產(chǎn)生的anti-HBs水平，高劑量組要明顯優(yōu)于HB vaccine組。Anti-HBs免疫球蛋白亞型IgG1的

21、水平經(jīng)CS3作用后下降，IgG2a的水平顯著升高，且Ig2a/IgG1的值與HB vaccine組相比明顯升高（*p＜0.05），說(shuō)明CS3用作HBsAg佐劑可以使機(jī)體免疫類(lèi)型向Th1方向發(fā)展。
　　創(chuàng)新性和結(jié)論：
　　(1)首次采用DMSO/SO3-吡啶反應(yīng)體系，制備了不同(M)w和S含量的curdlan sulfates，此法安全方便，毒性較低，并且所得樣品的(M)w和S含量隨反應(yīng)溫度的升高而降低。
　　(2)首次

22、研究了curdlan sulfate的體外免疫調(diào)節(jié)活性，樣品CS3可以促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、RAW264.7細(xì)胞活化及BMDCs成熟。
　　(3)首次采用SPR技術(shù)研究了curdlan sulfate與curdlan已知受體dectin-1的結(jié)合情況，確定dectin-1是curdlan sulfate的主要受體，明確CS3發(fā)揮體外免疫調(diào)節(jié)活性的機(jī)制是通過(guò)與免疫細(xì)胞表面dectin-1受體結(jié)合，激活MAPKs信號(hào)通過(guò)中的Erk1

23、/2和SAPK/JNK途徑，導(dǎo)致NF-κB向核內(nèi)移位，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。
　　(4)首次研究了curdlan sulfate體外抗HBV感染的活性，發(fā)現(xiàn)CS3可以抑制HBV感染HepG2和HepaRG細(xì)胞，并且主要是干擾HBV黏附細(xì)胞的過(guò)程。
　　(5)采用氯酸鈉、HPA處理HepG2和HepaRG細(xì)胞發(fā)現(xiàn)HS在HBV感染細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮一定的作用，借助SPR技術(shù)研究curdlan sulfates與重組HBsAg的結(jié)合能力