異種脫細(xì)胞基質(zhì)材料在陰道重建及盆底修復(fù)中的動物實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　 利用異種(豬皮、牛心包)來源的ATM組織工程補(bǔ)片，在實驗動物中國小型實驗豬體內(nèi)建立陰道重建及陰道粘膜下生物補(bǔ)片埋植的動物模型，針對重建后人工陰道進(jìn)行組織病理學(xué)評價，針對陰道埋植模型進(jìn)行補(bǔ)片功能學(xué)、組織相容性及降解率評估。以期判定異種ATM補(bǔ)片是否為人工陰道重建及盆底修復(fù)手術(shù)的理想材料，從而為人工陰道成型術(shù)及盆底修復(fù)手術(shù)開辟新的道路。
　　 材料及方法：
　　 1、動物實驗:1)選取中國小型實驗豬

2、為實驗動物，建立其陰道缺損及利用異種(B型牛心包來源和P型豬皮來源)來源的ATM補(bǔ)片重建新陰道模型，對小型豬圍手術(shù)期、術(shù)后恢復(fù)情況以及人工重建之陰道的生長情況進(jìn)行觀察。
　　 2)另取一組中國小型實驗豬，將其陰道粘膜前后壁全層分離，并在其內(nèi)埋植ATM補(bǔ)片(B型牛心包來源和P型豬皮來源)和人工合成補(bǔ)片，制成三種材料的在體模型，并對小型豬圍手術(shù)期、術(shù)后恢復(fù)情況以及補(bǔ)片代謝情況進(jìn)行觀察。
　　 2、人工陰道重建模型組織學(xué)觀察:

3、1)陰道重建術(shù)后1周、2周、4周、6周、8周分別陰道全層取材，并以其中2只小型實驗豬模型構(gòu)建時手術(shù)中取材的正常陰道組織作為對照。
　　 2)取材后進(jìn)行大體觀察、HE染色、VG染色和免疫組化染色，從組織學(xué)水平動態(tài)評價新生陰道變化并運(yùn)用免疫組化技術(shù)在蛋白水平對新生陰道粘膜及平滑肌進(jìn)行鑒定。免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記層粘連蛋白Laminin單克隆抗體，證明新生陰道粘膜是否具有基底膜成分。
　　 3)在透射電鏡下觀察第1周時ATM補(bǔ)片

4、的立體結(jié)構(gòu)、膠原成分與周圍反應(yīng)的變化情況。
　　 3、在ATM補(bǔ)片和人工合成補(bǔ)片植入小型豬體內(nèi)之前，在力學(xué)試驗機(jī)上進(jìn)行拉伸試驗，考察三種材料初始斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率等力學(xué)特性；
　　 4、盆底修復(fù)動物模型觀察:1)B型、P型ATM組分別在術(shù)后2周、4周、6周、8周、12周，人工補(bǔ)片對照在分別在術(shù)后2周、4周、8周各1只取材，取材范圍包括全層陰道2)取材后進(jìn)行大體、HE染色、ET+VG染色，動態(tài)觀察補(bǔ)片在動物體內(nèi)分解代謝、

5、與周圍基質(zhì)相互轉(zhuǎn)化情況，以及補(bǔ)片周圍粘膜反應(yīng)。
　　 3)在透射電鏡下觀察6周和8周時殘存ATM補(bǔ)片的立體結(jié)構(gòu)與周圍反應(yīng)的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、小型豬陰道重建手術(shù)建模成功，手術(shù)切口全部如期愈合，未見感染、血腫、排斥等并發(fā)癥。在預(yù)期時間段取材，未見陰道狹窄、塌陷或補(bǔ)片脫出等，再生陰道組織生長良好。
　　 2、P型ATM補(bǔ)片重建之陰道與前人利用同種異體ATM補(bǔ)片進(jìn)行陰道重建結(jié)果基本一致，但初始上

6、皮化的時間略晚。P型ATM補(bǔ)片重建陰道2周觀察時才出現(xiàn)清晰的新生粘膜，陰道3/4已有粘膜覆蓋，上段1/4仍可見少量補(bǔ)片殘存，測量新生陰道長度5cm；鏡下可見上皮層數(shù)少，在2-4層左右，平坦，極向不明確。4-6周時陰道內(nèi)腔繼續(xù)上皮化，外觀漸接近正常陰道粘膜，補(bǔ)片結(jié)構(gòu)肉眼不可見；鏡下可見粘膜上皮層數(shù)逐漸增多，極向恢復(fù)，接近正常上皮層結(jié)構(gòu)。8周時新生陰道從外觀上和組織形態(tài)學(xué)檢查與正常陰道已無明顯差異。上皮光譜角蛋白單克隆抗體AE1/AE3免疫

7、組織化學(xué)染色證明陰道內(nèi)腔有上皮組織存在，且從重建第2周開始出現(xiàn)陽性，其結(jié)果與HE染色觀察結(jié)果一致。VG染色及平滑肌肌動蛋白單克隆抗體α-actin的免疫組織化學(xué)染色顯示，自陰道重建后第4周，基質(zhì)中就開始出現(xiàn)散在、分布不規(guī)則的平滑肌肌細(xì)胞，此后隨著時間延長，漸形成排列均勻的肌束。
　　 3、VG染色在陰道重建第1周，可見殘存補(bǔ)片結(jié)構(gòu)以膠原纖維和彈性纖維為主；2周時，在陰道重建取材的基質(zhì)中，膠原纖維排列疏松，之后隨著時間推移，膠原纖

8、維排列漸致密，8周時膠原纖維排列致密?；|(zhì)中層粘連蛋白單克隆抗體Lamuun的免疫組化染色陽性，提示新生陰道粘膜具有基底膜成分，證明了新生陰道粘膜的完整性。B型補(bǔ)片因其本身的質(zhì)地韌且較厚實，無法與穴道四壁貼合緊密，血供不佳，影響補(bǔ)片的支架作用，故上皮化效果差，認(rèn)為不適宜作為陰道重建之材料。
　　 4、在將材料植入動物陰道粘膜下層之前對三種補(bǔ)片的力學(xué)特性進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示:B型補(bǔ)片(牛心包來源)的平均抗拉強(qiáng)度為8.18MPa，平

9、均斷裂伸長率為60.93％；P型補(bǔ)片(豬真皮來源)平均抗拉強(qiáng)度為12.64MPa，平均斷裂伸長率為7.66％；人工合成補(bǔ)片的平均抗拉強(qiáng)度為8.51MPa，平均斷裂伸長率為98.82％。說明B型和P型補(bǔ)片在離體情況下，抗拉強(qiáng)度均與人工合成補(bǔ)片的水平相當(dāng)。但P型補(bǔ)片韌性較差。
　　 5、小型豬陰道粘膜下ATM補(bǔ)片埋植模型建模順利，手術(shù)切口全部如期愈合，未見感染、血腫、排斥等并發(fā)癥，觀察期內(nèi)三種補(bǔ)片均無補(bǔ)片脫出、陰道侵蝕等現(xiàn)象。

10、>　　 6、大體和組織學(xué)觀察B、P兩型ATM補(bǔ)片在動物體內(nèi)都存在降解，且大致規(guī)律相同，在體內(nèi)均引起異物反應(yīng)，這可能是造成降解的原因。電鏡下可以觀察到ATM補(bǔ)片與宿主基質(zhì)交錯排列，兩側(cè)新生肉芽豐富。與ATM材料相比，人工合成補(bǔ)片的反應(yīng)較為均一，宿主組織較好的融合進(jìn)入補(bǔ)片網(wǎng)眼之間，周圍可見新生膠原纖維、成纖維細(xì)胞、血管和彈力纖維。
　　 結(jié)論：
　　 1、進(jìn)一步完善實驗動物小型豬構(gòu)建陰道缺損模型制備，首次在實驗動物小型豬體

11、內(nèi)建立陰道內(nèi)補(bǔ)片埋植模型，以此模擬動物陰道粘膜周圍環(huán)境，得到補(bǔ)片及其周圍結(jié)構(gòu)變化的組織學(xué)證據(jù)。模型構(gòu)建穩(wěn)定可靠，證明實驗用小型豬是進(jìn)行婦科缺損性疾病研究的理想實驗動物。
　　 2、從實驗動物圍手術(shù)期和術(shù)后短期觀察結(jié)果以及新生陰道的大體和組織形態(tài)學(xué)觀察，證明利用異種P型(豬皮)來源ATM材料進(jìn)行陰道重建，可以取得與同種異體(人尸皮)來源ATM類似的效果，可以作為陰道重建術(shù)的修補(bǔ)材料，且因其制作原料為豬皮，來源廣泛，價格低廉，具有廣

12、闊的應(yīng)用前景。B型(牛心包來源)補(bǔ)片因其物理性質(zhì)較為堅韌，難以與陰道造穴貼合，不適合作為陰道重建之材料。
　　 3、從植入動物體內(nèi)之前對人工合成聚丙烯網(wǎng)片、P型豬皮來源及B型牛心包來源ATM補(bǔ)片進(jìn)行拉力測試的結(jié)果分析:B型(牛心包)、P(豬皮)型ATM補(bǔ)片的早期抗強(qiáng)度與人工合成補(bǔ)片水平相當(dāng)，但P型補(bǔ)片韌性較差。
　　 4、在術(shù)后最長3個月的觀察期內(nèi)，大體和組織形態(tài)學(xué)證據(jù)表明:異種ATM補(bǔ)片周圍存在異物反應(yīng)，且呈明顯降解，