Galectin-9及其受體Tim-3在哮喘小鼠肺組織中的表達(dá)及作用.pdf

1、哮喘是一免疫失衡性疾病,即T淋巴細(xì)胞控制著炎癥反應(yīng),Th1／Th2反應(yīng)性失衡,Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答異常增高,Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答減弱在哮喘的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用,此平衡失調(diào)被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制。糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用巨大的改變了哮喘患者的臨床癥狀及生存質(zhì)量,成為支氣管哮喘治療的經(jīng)典用藥。然而,長(zhǎng)期應(yīng)用尤其在大劑量應(yīng)用時(shí)具有明顯的毒副作用；對(duì)少數(shù)重癥哮喘患者可能存在對(duì)糖皮質(zhì)激素治療不敏感或是抵抗。因此人們一直為更有效的治療哮喘尋求新突破

2、,在變應(yīng)性疾病中半乳糖凝集素-9(Galectin-9)和T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(Tim-3)在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平都有明顯升高,并且其改變與Th1／Th2細(xì)胞因子含量有直接關(guān)系,它們與變應(yīng)性炎癥過程密切相關(guān)。因此本研究探討性的把Galectin-9及特異性表達(dá)于Th1細(xì)胞表面的Tim-3分子作為免疫調(diào)節(jié)的靶分子,通過免疫調(diào)節(jié)使哮喘中Th1／Th2反應(yīng)失衡恢復(fù)平衡,以期能為哮喘發(fā)病機(jī)制研究與臨床治療提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　

3、 目的：本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠哮喘模型,探討Galectin-9及其受體Tim-3在哮喘小鼠肺組織中的表達(dá)及過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-γ)激動(dòng)劑羅格列酮(ROS)對(duì)其表達(dá)的影響,并與Th1／Th2細(xì)胞因子進(jìn)行相關(guān)性分析,探討Galectin-9及Tim-3對(duì)Th1／Th2平衡的影響機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 1.動(dòng)物分組和模型制作方法清潔級(jí)BALB／c小鼠45只,雌性,5—8周齡,體重18-22g,購(gòu)自鄭

4、州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按隨機(jī)數(shù)字表法分為哮喘組、對(duì)照組、ROS干預(yù)組,每組各15只。哮喘組小鼠給予1％OVA／Al(OH)3混懸液0.2ml于第1d、7d、14d腹腔注射聯(lián)合皮下注射致敏,共三次；第21d開始用2％OVA霧化吸入激發(fā),每次30min,每日1次,持續(xù)2周；干預(yù)組于第28d起在激發(fā)前30min給予PPAR—γ激動(dòng)劑羅格列酮灌胃干預(yù)(10mg／kg),持續(xù)1周；對(duì)照組用等量生理鹽水致敏和霧化吸入,余同哮喘組。卵蛋白、羅格列酮液每

5、次現(xiàn)配現(xiàn)用。
　　 2.標(biāo)本處理
　　 血清收集:末次激發(fā)后24h內(nèi),無菌條件下眼球動(dòng)脈取血,收集外周血0.8ml置于EP管中,4℃靜置2h,3000rpm／min離心10min,取上清液分裝,于-80℃保存?zhèn)渥鱁LISA分析。肺組織標(biāo)本:采血后用戊巴比妥鈉(45mg／kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉,迅速開胸,暴露肺臟,觀察肺臟大體改變,取左側(cè)肺組織,快速放于液氮中凍存,留作PT-PCR實(shí)驗(yàn)用。然后經(jīng)右心室插管至肺動(dòng)脈,用生理鹽

6、水沖洗后取右肺中葉,置于4％的多聚甲醛溶液中固定24h,依次酒精梯度脫水,常規(guī)石蠟包埋,做厚度約5μm切片,行HE染色后,光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織、各級(jí)支氣管及血管周圍炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。
　　 3.ELISA檢測(cè)血清中IL-4及IFN-γ含量實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格參照試劑說明書進(jìn)行,加終止液混勻后立即由自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度OD450值,以O(shè)D值為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,據(jù)樣品的OD值確定其濃度。
　　 4.RT-PC

7、R將液氮凍存的左肺組織用Trizol一步提取法提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的片段。擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,用Band Scan5.0凝膠分析軟件分別測(cè)定Galectin-9、Tim-3和內(nèi)參GAPDH的灰度值,并以Galectin-9、Tim-3與內(nèi)參GAPDH的比值作為該小鼠的代表值。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示

8、。多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；各因素間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.病理學(xué)改變
　　 小鼠肺組織切片HE染色顯示:對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整,氣管形態(tài)規(guī)則,粘膜上皮完整,各級(jí)支氣管、肺泡、血管周圍未見有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡形態(tài)規(guī)則,各支氣管平滑肌未見增生,支氣管腔內(nèi)僅有少量分泌物。哮喘組小鼠肺組織切片可見肺內(nèi)支氣管粘膜下及

9、血管周圍有較多EOS浸潤(rùn),粘膜下充血水腫,粘液腺增生,氣道上皮細(xì)胞的脫落和上皮組織多處斷裂,支氣管腔內(nèi)和肺間質(zhì)處可見大量分泌物和炎性細(xì)胞滲出,支氣管壁及基底膜可見輕度增厚且形態(tài)不規(guī)則。ROS組小鼠肺組織仍可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變,但較哮喘組減輕。
　　 2.ELISA結(jié)果哮喘組IL-4含量(564.48±76.17)較對(duì)照組(347.55±44.31)、ROS組(483.81±68.36)有不同程度的增高；而IFN-γ含量

10、(371.56±131.49)與對(duì)照組(599.21±105.31)、ROS組(398.67±120.67)比較有顯著減弱,組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 3.RT-PCR結(jié)果Galectin-9及Tim-3mRNA在對(duì)照組肺組織中僅有少量表達(dá)(0.305±0.051,0.296±0.054),而在哮喘組肺組織中表達(dá)量顯著增加(0.614±0.092,0.542±0.084),ROS組二者的表達(dá)量較哮喘組降低但

11、仍高于對(duì)照組(0.401±0.059,0.466±0.091),各組問差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)(p<0.05)4相關(guān)性分析對(duì)肺組織內(nèi)Galectin-9及Tim-3mRNA表達(dá)量與血清中Th1及Th2的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,結(jié)果示:二者的表達(dá)強(qiáng)度與IL-4蛋白含量成正相關(guān)(r=0.691 r=0.568 p<0.01),與IFN-γ蛋白含量成負(fù)相關(guān)(r=-0.507 r=-0.403 p<0.01)。