Tim-3-Galectin-9通路在肺移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)中的作用研究.pdf

1、本文分三個部分進行探討：
　　第一部分：Tim-3及其配體Galectin-9在大鼠肺移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)期的表達(dá)及意義
　　背景：肺移植是目前治療終末期肺病唯一有效的方法。盡管手術(shù)技術(shù)及免疫抑制劑在不斷改進，然而臨床上較之其他實體器官移植預(yù)后仍較差，急性排斥反應(yīng)的發(fā)生是影響其預(yù)后的一個危險因素。因此對AR進行早期監(jiān)測診斷并進行有效治療，對于改善肺移植患者的預(yù)后至關(guān)重要。近年來大量文獻(xiàn)證實Tim-3及其配體Galectin-

2、9在人類腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)期顯著性升高，并推斷其可作為腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)發(fā)生的預(yù)測因子。
　　目的：通過檢測Tim-3及其配體Galectin-9在大鼠肺移植術(shù)后AR期移植物中的表達(dá)，探討其對肺移植術(shù)后AR發(fā)生的影響及意義。
　　方法：借助大鼠左肺原位移植模型作為研究對象，受體大鼠未給予任何免疫抑制劑，分別設(shè)立同基因組（Lewis-Lewis）和同種組（Fisher344-Lewis），移植物分別在肺移植術(shù)后第3、7以及10

3、天，組織病理學(xué)評估急性排斥反應(yīng)的級別；免疫組織化學(xué)檢測移植物內(nèi)浸潤的T淋巴細(xì)胞；應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)法檢測Tim-3在T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)；實時定量PCR檢測移植物內(nèi)Tim-3、Galectin-9及相關(guān)炎癥因子mRNA的表達(dá)并進行相關(guān)分析。
　　結(jié)果：肺移植術(shù)后，在上述不同時間點同基因組移植肺接近于正常肺組織，無排斥現(xiàn)象發(fā)生或排斥級別較低；而與同基因組不同，同種組移植肺在AR期隨時間的變化其排斥程度逐漸加重。通過免疫學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)CD4/

4、CD8比值的下降與AR發(fā)生的嚴(yán)重程度相關(guān)；與同基因組相比，Tim-3及Galectin9在AR期同種組移植肺內(nèi)的表達(dá)顯著性升高（P<0.05），而且Tim-3在CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)也顯著性升高（P<0.05）。在mRNA水平，Tim-3、Galectin-9及炎癥因子IFN-γ、IL-17在AR期同種組移植肺內(nèi)的表達(dá)也顯著性上升（P<0.05），其中Tim-3的表達(dá)與IFN-γ及IL-17呈正相關(guān)，并且與Galectin

5、-9的表達(dá)有一定的相關(guān)性；而Galectin-9的表達(dá)水平與IFN-γ的表達(dá)及AR發(fā)生的嚴(yán)重程度也存在一定的關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)論：本研究首次表明Tim-3及其配體Galectin-9在同種異體移植肺內(nèi)急性排斥反應(yīng)期顯著性升高，在大鼠肺移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)病機制中起著重要作用，并可作為肺移植術(shù)后檢測急性排斥反應(yīng)發(fā)生的一種新的預(yù)測因子。
　　第二部分：重組人Galectin-9蛋白的體外合成及其對肺移植術(shù)后T淋巴細(xì)胞的作用檢測

6、
　　背景：半乳糖凝集素-9（Galectin-9）是一種糖結(jié)合蛋白，屬于半乳糖凝集素家族（Galectin family）成員，組織分布廣泛，在介導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡、粘附、細(xì)胞間聚集、炎癥反應(yīng)的調(diào)控和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要作用。近年來國內(nèi)外學(xué)者通過體外合成Galectin-9蛋白并進行相關(guān)的實驗研究，對其生物學(xué)特性有了更深一步的了解。
　　目的：本研究旨在通過全基因合成法體外合成重組人Galectin-9蛋白，并檢測其對肺

7、移植術(shù)后的T淋巴細(xì)胞作用，為進一步研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法：本實驗利用密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化人Galectin-9基因，采用全基因合成法合成優(yōu)化后的人Galectin-9基因片段，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Galectin-9，然后進行DNA序列分析鑒定，并將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感受態(tài)的大腸桿菌BL21（DE3），構(gòu)建蛋白表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)、純化、鑒定人重組Galectin-9蛋白抗原活性。取同種異體左肺原

8、位移植術(shù)后3天的小鼠（BALB/c-C57BL/6）脾臟細(xì)胞，分離出T淋巴細(xì)胞，并加入不同濃度的人重組Galectin-9蛋白體外培養(yǎng)72小時，采用MTT法檢測T淋巴細(xì)胞的增殖，ELISA法檢測細(xì)胞上清中炎癥因子的水平。
　　結(jié)果：全基因合成了人Galectin-9基因序列，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Galectin-9，經(jīng)酶切鑒定和DNA序列測序分析正確，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)宿主，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物并純化，經(jīng)SDS-PAGE

9、和Western Blot分析，表明表達(dá)蛋白為重組人Galectin-9蛋白并具有抗原活性。重組人Galectin-9蛋白體外對T淋巴細(xì)胞的增殖有明顯地抑制作用，這種抑制作用呈濃度依賴性，并能顯著減少T淋巴細(xì)胞分泌炎癥因子IFN-γ及IL-17（P<0.05），而對IL-4的分泌影響不明顯（P>0.05）。
　　結(jié)論：本實驗成功構(gòu)建含有人Galectin-9序列的原核表達(dá)載體pET28a-Galectin-9，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)及純化，獲

10、得了純度≥90％的重組人Galectin-9蛋白，并發(fā)現(xiàn)其體外能顯著抑制抗原致敏后的T淋巴細(xì)胞的增殖及減少炎癥因子的釋放，為進一步研究進行相關(guān)的體內(nèi)實驗奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分：激活Tim-3/Galectin-9通路能顯著減輕小鼠同種異體肺移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)
　　背景：目前已知的研究表明Tim-3優(yōu)先表達(dá)于Th1和Th17細(xì)胞表面，在自身免疫性疾病和同種免疫性疾病中均發(fā)揮著重要作用。Galectin-9是目前確定的T

11、im-3的配體且由此而建立的Tim-3/Galectin-9通路在調(diào)節(jié)Th1及Th17免疫反應(yīng)中起著重要的作用。近年來，國內(nèi)外研究者通過給予重組Galectin-9蛋白激活Tim-3/Galectin-9通路，在自身免疫性疾病和同種免疫性疾病的動物模型中，均起到了良好的保護作用，但是否對肺移植術(shù)后移植物有類似的保護作用目前尚未有報道。
　　目的：觀察給予重組人Galectin-9蛋白對同種異體小鼠肺移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的影響，探討

12、外源性Galectin-9激活Tim-3/Galectin-9通路在小鼠肺移植模型中的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　方法：建立小鼠同種異體左肺原位移植模型（BALB/c-C57BL/6），分別建立實驗組和對照組。實驗組受者術(shù)后連續(xù)7天給予重組人Galectin-9蛋白，對照組則給予PBS。術(shù)后第7天分別獲取實驗組和對照組的移植肺，病理切片觀察排斥反應(yīng)情況，免疫組化觀察移植物內(nèi)浸潤的CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量及Tim-3+細(xì)胞數(shù)量。實時定量

13、PCR檢測移植物內(nèi)的相關(guān)因子的mRNA表達(dá)。TUNNEL法檢測移植肺內(nèi)的凋亡細(xì)胞數(shù)。
　　結(jié)果：與對照組相比，病理學(xué)檢測顯示重組人Galectin-9蛋白治療組移植肺的排斥反應(yīng)明顯減輕（P<0.05）；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示浸潤的CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)及Tim-3+細(xì)胞數(shù)均明顯減少（P<0.05）；給予重組人Galectin-9蛋白后移植物內(nèi)的Tim-3、IFN-γ及IL-17mRNA的表達(dá)明顯減少（P<0.05），而Foxp3