Tim-1-Fc抑制同種移植物排斥反應(yīng)的作用與機制.pdf

1、CD4+T輔助細(xì)胞的活化、增殖和分化是抗原特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。該反應(yīng)的產(chǎn)生除了需要抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cells,APCs)提供抗原肽/MHC復(fù)合物與T細(xì)胞受體特異性結(jié)合外,還必須有APCs提供協(xié)同刺激分子如免疫球蛋白家族成員(CD80、ICOSL等)、TNF家族成員(CD40、OX40、4-1BB、CD27、LIGHT等)和多種細(xì)胞因子的參與。隨著研究的深入,不斷有新的分子被發(fā)現(xiàn)參與、調(diào)控了T

2、細(xì)胞的活化過程。因此,T細(xì)胞的活化與調(diào)節(jié)仍然是基礎(chǔ)免疫學(xué)研究的重點,也是移植免疫學(xué)關(guān)注的熱點。
　　 T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白(T cell immunoglobulin mucin,Tim)是2001年發(fā)現(xiàn)的表達在T細(xì)胞和DCs表面與細(xì)胞活化相關(guān)的新分子。小鼠TIM基因家族位于11B1.1,目前共發(fā)現(xiàn)8個基因,編碼蛋白Tim-1～4和4個假想蛋白Tim-5～8。人類TIM基因家族只有3個成員,定位于染色體5q33.2,分別編碼蛋

3、白Tim-1,3,4(沒有Tim-2)。Tim是一類具有共同基序的跨膜糖蛋白,其結(jié)構(gòu)包括免疫球蛋白(Ig)樣區(qū)、粘蛋白樣區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。除Tim-4外,Tim-1,2,3的胞內(nèi)區(qū)均含有酪氨酸激酶磷酸化位點,直接參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 早期研究發(fā)現(xiàn),Tim-1表達于所有活化的CD4+T細(xì)胞,并在其分化后仍高表達于Th2細(xì)胞,而低表達于Th1,Th17,CD11c+骨髓源性樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)和CD

4、19+B細(xì)胞。Tim-1的配體為Tim-4,與其它Tim蛋白不同,小鼠Tim-4只表達于APCs。它作為Tim-1的配體參與T細(xì)胞的活化和增殖,并能減少其凋亡。Tim-3主要表達于Th1細(xì)胞和DCs,它與DCs上的Galectin-9結(jié)合后能導(dǎo)致Th1細(xì)胞的凋亡。
　　 然而,隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)Tim-1和Tim-4在免疫調(diào)節(jié)中的作用比預(yù)想的更為復(fù)雜。最近的研究顯示,小鼠Tim-4與人IgG1 Fc段融合蛋白(Tim-4-

5、Ig)在不同的終濃度下能刺激或抑制培養(yǎng)體系中T細(xì)胞的活化。另外,Tim-4-Ig可以通過與小鼠初始CD4+T細(xì)胞上的某種配體結(jié)合抑制其活化,經(jīng)證實,這種配體并非Tim-1。然而,Tim-4-Ig的這種作用只局限于不表達Tim-1的小鼠初始T細(xì)胞,它不能抑制預(yù)先激活的T細(xì)胞增殖。上述研究提示Tim-4-Ig可以與T細(xì)胞上的不同配體結(jié)合,介導(dǎo)不同的免疫效應(yīng)。此外,Tim-1的不同單克隆抗體(383和RMT1-10)也可以對T細(xì)胞活化產(chǎn)生相反

6、的作用,這可能取決于它們與Tim-1結(jié)合的親和力不同或?qū)?xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響不同。因此,進一步闡明Tim-1調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)的機制,對于開發(fā)治療自身免疫性疾病和移植物排斥反應(yīng)的新藥物,具有重要的意義。
　　 基于上述研究,本課題擬進一步:(1)合成人源化Tim-1胞外段和IgG1 Fc段融合蛋白(Tim-1-Fc),檢測其與小鼠不同種類細(xì)胞的結(jié)合情況,驗證其是否具有交叉活性,并判定這種可能的結(jié)合是否是Tim-4依賴性的；(2)體外研

7、究Tim-1-Fc對anti-CD3,anti-CD28 mAbs介導(dǎo)的小鼠CD4+T細(xì)胞活化,增殖,凋亡,細(xì)胞周期和對同種DCs介導(dǎo)的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Allogeneic mixed lymphocyte response,allo-MLR)的影響,探討其胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；觀察其對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Tregs)增殖和叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3(Forkhead transcription factor p3

8、,Foxp3)表達的影響；(3)通過腹腔注射Tim-1-Fc(對照組注射PBS和人IgG1),阻斷Tim-4-Tim-1介導(dǎo)的T細(xì)胞活化,觀察其對小鼠頸部異位心臟移植物生存期的影響,初步揭示其抑制移植排斥反應(yīng)的作用和體內(nèi)機制；通過本課題研究,有望進一步認(rèn)識Tim-1-Fc分子在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和抑制同種移植物排斥反應(yīng)中的作用,為尋找臨床免疫抑制治療的新靶點提供實驗依據(jù)。
　　 第一部分 Tim-1-Fc的制備
　　

9、目的:合成人源化Tim-1胞外段和IgG1 Fc段融合蛋白(Tim-1-Fc),檢測其與小鼠不同細(xì)胞結(jié)合情況,驗證其是否具有交叉活性,并判定這種可能的結(jié)合是否是Tim-4依賴性的。方法:從基因庫中搜索人Tim-1胞外段和IgG1 Fc段的cDNA序列,克隆到哺乳動物細(xì)胞表達載體pcDNA3.1上,利用轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary,CHO)中,通過Western-blot檢測Tim-1

10、-Fc表達情況,經(jīng)親和、離子交換等多種層析方法純化蛋白。采用流式細(xì)胞儀(Flow cytometry,FCM)檢測Tim-1-Fc與未接受刺激的或刺激3天后的小鼠DCs,CD4+CD25-T細(xì)胞,CD4+CD25+T細(xì)胞(Natural regulatory T cells,nTregs)結(jié)合情況,加入Tim-4單抗,阻斷可能的Tim-4-Tim-1-Fc結(jié)合。結(jié)果:經(jīng)Western-blot檢測,合成的Tim-1-Fc分子量約62KD

11、,純度>92％。Tim-1-Fc不結(jié)合DCs,nTregs和未活化的CD4+CD25-T細(xì)胞,但能選擇性結(jié)合活化后的CD4+CD25-T細(xì)胞(Effector T cells,Teffs),且該作用不被anti-Tim-4 mAb阻斷。結(jié)論:Tim-1-Fc構(gòu)建成功。小鼠Teffs上存在人Tim-1的新型配體。
　　 第二部分體外Tim-1-Fc對小鼠T細(xì)胞抗原反應(yīng)性的影響
　　 目的:觀察Tim-1-Fc在體外對CD4

12、+T細(xì)胞活化,增殖,凋亡和細(xì)胞周期,胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),allo-MLR以及nTregs增殖、Fxop3表達的影響。方法:在CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入不同終濃度的Tim-1-Fc(1,5,10μg/ml),按不同比例(1:40,1:20,1:10)將DC與CD4+T細(xì)胞混合培養(yǎng),采用3H摻入法檢測細(xì)胞增殖,CSFE檢測細(xì)胞分裂,ELISA檢測培養(yǎng)上清液中Th1/Th2細(xì)胞因子分泌情況,PI/Annexin V雙染色法檢測各組CD4+T細(xì)胞凋

13、亡的比例,RT-PCR法檢測Tim-1-Fc對nTregs內(nèi)Foxp3基因轉(zhuǎn)錄的影響,Western-blot檢測Tim-1-Fc對細(xì)胞周期蛋白Cdk2,Cdk4,p27kip表達及anti-CD3(2μg/ml),anti-CD28(1μg/ml)mAbs刺激后不同時間點(5,15,30min)CD4+T細(xì)胞內(nèi)信號分子AKT,ERK1/2磷酸化情況的影響。結(jié)果:Tim-1-Fc不但能抑制CD4+T細(xì)胞表面活化標(biāo)志CD25,CD69表達

14、、抑制細(xì)胞分裂增殖,該作用不依賴于Tim-4(RT-PCR和FCM檢測也未發(fā)現(xiàn)小鼠T細(xì)胞表達Tim-4)；還能顯著下調(diào)Cdk2,Cdk4而增加p27kip表達,使細(xì)胞停滯在G1期；抑制CD4+T細(xì)胞內(nèi)AKT,ERK1/2磷酸化；抑制allo-MLR,誘導(dǎo)T細(xì)胞對同種抗原的低反應(yīng)性,減少IL-2,IFN-γ而促進IL-10的分泌。但Tim-1-Fc對CD4+T細(xì)胞凋亡,nTregs增殖和Foxp3表達無明顯影響。結(jié)論:Tim-1-Fc在體

15、外能通過與T細(xì)胞表面新型受體結(jié)合抑制CD4+T細(xì)胞活化、增殖和Th1源性細(xì)胞因子表達,使細(xì)胞停滯在G0/G1期,并下調(diào)T細(xì)胞內(nèi)信號分子AKT,ERK1/2磷酸化水平。還能抑制小鼠allo-MLR,誘導(dǎo)T細(xì)胞對同種抗原的低反應(yīng)性；但它不影響CD4+T細(xì)胞凋亡,nTregs增殖和Foxp3表達。
　　 第三部分 Tim-1-Fc抑制小鼠同種心臟移植物排斥反應(yīng)的作用與機制
　　 目的:觀察Tim-1-Fc對小鼠心臟移植物存活期

16、的影響并探討其抑制排斥反應(yīng)的體內(nèi)機制。方法:采用BALB/c→C57BL/6小鼠頸部異位心臟移植模型,將受體分為3組(每組n=10):組1,心臟移植+PBS治療組；組2,心臟移植+hIgG1(10μg/g/天術(shù)后0～6天)治療組;組3,心臟移植+Tim-1-Fc(10μg/g/天術(shù)后0～6天)腹腔注射治療組。專人記錄心臟移植物存活時間。于術(shù)后第7天處死小鼠,收集血液、心臟、脾臟標(biāo)本。Real-time PCR檢測心臟移植物內(nèi)淋巴細(xì)胞表面

17、分子CD3,CD11b和炎性細(xì)胞因子IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-10和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達情況,病理檢查心臟移植物內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤和組織破壞情況。磁珠分選受體小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞,用BALB/c小鼠DCs刺激,3H摻入法檢測其增殖情況,ELISA檢測Th1,Th2細(xì)胞因子水平。FCM檢測受體小鼠脾臟中CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞比例,以及CD4+CD25-T細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入Tim-1-Fc后Foxp3

18、的表達變化。結(jié)果:三組小鼠心臟移植物存活時間分別為6.5±0.5,6.7±0.4和17.1±1.1天。Tim-1-Fc治療組移植物內(nèi)IL-2、IFN-γ、CD11b、CD3 mRNA表達水平顯著較低,病理損害亦明顯減輕,但IL-10水平升高(P<0.05)；Tim-1-Fc組受體脾臟來源CD4+T細(xì)胞接受同種異基因DCs刺激后增殖水平顯著較低(P<0.05)；受體小鼠脾臟中CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞比例顯著升高(

19、P<0.05),但 Tim-1-Fc并不能直接誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞表達Foxp3。結(jié)論:Tim-1-Fc能減輕小鼠心臟移植物Th1細(xì)胞因子表達和炎性細(xì)胞浸潤,促進Th2細(xì)胞因子表達,降低受體脾臟內(nèi)供體反應(yīng)性T細(xì)胞對同種抗原的反應(yīng)能力,顯著延長移植物存活期；Tim-1-Fc雖不能直接誘導(dǎo)Tregs,但它通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡向Th2發(fā)展,提高脾臟內(nèi)CD4+Foxp3+T細(xì)胞比例,調(diào)節(jié)Teffs/Tregs平衡向Tregs偏移,