Galectin-9在病毒性心肌炎發(fā)病中的作用及其機(jī)制.pdf

1、病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是一臨床常見心血管系統(tǒng)疾病。早在1899年Fiedler KL就曾報(bào)道過3例現(xiàn)代概念的VMC，此后，歐美各國(guó)VMC的臨床及尸檢報(bào)道日益增多。20世紀(jì)70年代后，中國(guó)及日本等亞洲國(guó)家相繼報(bào)道了VMC的發(fā)生，近年來尤其在我國(guó)，VMC的發(fā)病逐年上升，VMC已成為青少年不明原因猝死的主要原因之一。不僅如此，慢性VMC?？蓪?dǎo)致擴(kuò)張性心臟病的發(fā)生，在美國(guó)每年新增擴(kuò)張性心臟病病人多達(dá)100，0

2、00人，已成為心臟移植手術(shù)的重要原因之一。VMC嚴(yán)重危害生命健康，然而迄今為止，VMC的治療尚無有效的辦法，其根本原因在于VMC的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚，因此，闡明VMC的發(fā)病機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　目前認(rèn)為，VMC的發(fā)生是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜的過程，病毒感染是VMC重要的病因之一。腸道病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒、流感病毒、肝炎病毒等病毒感染都可以誘發(fā)VMC。其中腸道病毒尤其是柯薩奇病毒感染是最常見病因。B3型柯薩奇病毒(

3、coxsackievirus group B type 3，CVB3)，微小無衣殼正鏈RNA病毒，屬于小核糖核酸病毒科。早在20世紀(jì)50年代，B3型柯薩奇病毒已被發(fā)現(xiàn)能累及心肌，導(dǎo)致VMC。流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，CVB3感染在不同性別人群中發(fā)病率和嚴(yán)重程度明顯不同，VMC在男性人群中多發(fā)，癥狀也較為嚴(yán)重，并易發(fā)展為慢性心肌炎和擴(kuò)張性心肌病。與人類相似，CVB3感染的雌性和雄性BALB/c小鼠也顯示不同嚴(yán)重程度的心肌炎。盡管CVB3感染的發(fā)

4、病機(jī)制已經(jīng)研究了很多年，但直到近來才發(fā)現(xiàn)多種機(jī)制參與了CVB3誘導(dǎo)的VMC的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)程。
　　CD4+T細(xì)胞的免疫偏移可以影響VMC嚴(yán)重性。一方面，Th1型免疫應(yīng)答被認(rèn)為是引起心肌組織損傷的主要原因：有研究發(fā)現(xiàn)，CD4基因敲除小鼠中CVB3誘導(dǎo)的VMC可以得到有效的緩解，證實(shí)了CD4+T細(xì)胞在VMC中的作用；Huber等也發(fā)現(xiàn)CD4+Th1細(xì)胞應(yīng)答對(duì)于CVB3誘導(dǎo)的VMC是必需的。另一方面，CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regula

5、tory T cells，Tregs)可以降低心肌炎癥，緩解心肌炎的發(fā)??；Ono等發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)GITR的Foxp3+Tregs可以控制自身免疫性心肌炎；Huber等證實(shí)CVB3病毒突變體可以通過誘導(dǎo)和維持Tregs的數(shù)量，有效的緩解心肌炎。
　　炎性細(xì)胞因子在VMC的發(fā)病過程中也發(fā)揮重要作用。在易感小鼠中，心肌組織中IL-1β和IL-18水平的增加直接與疾病的嚴(yán)重性呈正相關(guān)；在非易感小鼠中，IL-1或TNF-α卻能促進(jìn)心肌炎的發(fā)病

6、。本室前期研究發(fā)現(xiàn)，外源性注射IL-4可以顯著改善CVB3感染小鼠的心肌炎癥和心肌炎的嚴(yán)重程度。因此，治療CVB3誘導(dǎo)的VMC理想的方法就是促進(jìn)細(xì)胞因子向抗炎因子轉(zhuǎn)化，同時(shí)誘導(dǎo)或擴(kuò)增抑制性細(xì)胞如CD4+Tregs。
　　Galectin-9，β半乳糖苷結(jié)合凝集素家族成員，可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞凋亡。通過Ca2+-caspasel信號(hào)途徑，galectin-9能優(yōu)先誘導(dǎo)活化CD4+T細(xì)胞發(fā)生凋亡。T細(xì)胞免疫球蛋白域和粘

7、蛋白域蛋白-3(T-cell immunoglobulindomain and mucin domain protein-3，Tim-3)，galectin-9的受體，選擇性表達(dá)于終末分化Th1細(xì)胞，在Th17、Tregs表面也有一定的表達(dá)。Galectin-9在體內(nèi)外均可以誘導(dǎo)Tim-3表達(dá)的細(xì)胞發(fā)生凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，galectin-9治療可以有效的緩解實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦炎，一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦炎。而且，在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型以及

8、HSV誘導(dǎo)的損傷模型中，galectin-9通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答，如抑制Th17的產(chǎn)生，同時(shí)促進(jìn)Tregs的分化和擴(kuò)增，從而達(dá)到治療疾病的目的。
　　在本研究中，我們用CVB3感染的雄性BALB/c小鼠，觀察CVB3感染后心肌中g(shù)alectin-9的表達(dá)變化，結(jié)果顯示CVB3感染后雄性BALB/c小鼠心肌galectin-9的表達(dá)顯著升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)galectin-9可以促進(jìn)Tregs的富集，并有效的緩解CVB3誘導(dǎo)的VMC。

9、那么galectin-9是通過什么機(jī)制緩解VMC的發(fā)作?是影響病毒復(fù)制還是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答?Galectin-9促進(jìn)Tregs富集的機(jī)制又是什么?因此，在本研究中我們利用CVB3感染的VMC模型，探討了Ralectin-9在VMC發(fā)病中的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　第一部分Galeetin-9在病毒性心肌炎發(fā)病中的作用
　　一、CVB3感染前后galectin-9的表達(dá)變化
　　Galectins屬于β半乳糖苷結(jié)合凝集素

10、家族。現(xiàn)有的研究表明，galectins在各種生理或病理過程中發(fā)揮重要作用，如免疫炎癥反應(yīng)、腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病等。其中g(shù)alectin-1，-3，-9在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
　　為了研究galectins在CVB3誘導(dǎo)的VMC中的作用，我們首先觀察了CVB3感染前后小鼠心肌中g(shù)alectin-1，-3，-9的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CVB3感染可以顯著上調(diào)小鼠心肌galectin-1，-9 mRNA的表達(dá)。由于

11、galectin-1在病毒感染中研究較為清楚，我們進(jìn)一步關(guān)注了CVB3感染前后galectin-9在不同組織中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)CVB3感染后，小鼠心肌、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中g(shù)alectin-9 mRNA的表達(dá)顯著升高。免疫組化結(jié)果也顯示CVB3感染增加了小鼠心肌中g(shù)alectin-9蛋白的表達(dá)。
　　述結(jié)果提示，galectin-9可能參與了CVB3誘導(dǎo)的VMC的發(fā)病。
　　二、Galectin-9治療前后BALB/c小鼠病

12、毒性心肌炎嚴(yán)重程度的差異
　　VMC以心肌間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為特征，導(dǎo)致心肌細(xì)胞灶性壞死，纖維化，最終導(dǎo)致心臟功能喪失。以CVB3感染小鼠建立心肌炎動(dòng)物模型，很好地模擬了臨床上VMC疾病過程。VMC的判斷指標(biāo)主要有體重減輕、血清學(xué)、病理學(xué)以及死亡率等。用galectin-9蛋白腹腔注射治療CVB3感染雄性BALB/c小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組小鼠在感染后第3天體重都開始下降，其中未治療組(PBS組)小鼠體重持續(xù)下降，至第7天體重減輕率達(dá)15

13、％，而galectin-9治療組BALB/c小鼠感染后第5天體重開始恢復(fù)，隨后體重逐漸增加。從血清學(xué)指標(biāo)來看，在感染后第7天，未治療組BALB/c小鼠血清CK、CK-MB的活性顯著升高，cTnI水平也明顯升高；而galectin-9治療組小鼠血清CK、CK-MB的活性和cTnI水平顯著低于未治療組小鼠。心臟組織HE染色顯示未治療組BALB/c小鼠心臟顯示片狀的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌細(xì)胞壞死，而galectin-9治療組小鼠心臟僅有少量炎性細(xì)

14、胞浸潤(rùn)；治療組小鼠心肌炎的炎癥面積遠(yuǎn)小于未治療組，而且治療組小鼠心臟浸潤(rùn)C(jī)D45+單個(gè)核細(xì)胞比例顯著降低。最后，從死亡率來看，至感染第10天，未治療組BALB/c小鼠的死亡率高達(dá)70％，而galectin-9治療組小鼠的死亡率僅為15％。綜合上述各項(xiàng)指標(biāo)可以看出，galectin-9治療可以顯著緩解CVB3誘導(dǎo)的VMC。
　　三、Galectin-9治療對(duì)CVB3感染小鼠炎癥性細(xì)胞因子分泌的影響
　　炎癥性細(xì)胞因子如TNF-

15、α、IFN-γ、IL-4和IL-10等在心肌炎的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。因此，我們檢測(cè)了galectin-9治療對(duì)小鼠心臟局部和血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10分泌的影響，發(fā)現(xiàn)galectin-9治療可以顯著下調(diào)促炎性細(xì)胞因子FNF-α和IFN-γ的分泌，同時(shí)促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子IL-4和IL-10的分泌。
　　以上結(jié)果顯示，galectin-9可以有效的緩解CVB3誘導(dǎo)的VMC，并促進(jìn)細(xì)胞因子微環(huán)境向

16、抗炎性轉(zhuǎn)化，證實(shí)galectin-9的確參與了VMC的發(fā)病。
　　第二部分Galectin-9在病毒性心肌炎中的作用機(jī)制探討
　　一、Galectin-9對(duì)病毒復(fù)制的影響
　　CVB3感染心肌細(xì)胞是誘發(fā)VMC的前提條件。由此我們必須排除一個(gè)可能即galectin-9緩解CVB3誘導(dǎo)的VMC是由于降低心肌病毒復(fù)制造成的。因此我們首先檢測(cè)了galectin-9治療前后CVB3感染的BALB/c小鼠心臟組織中CVB3病毒RN

17、A數(shù)量和病毒滴度的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)galectin-9并沒有引起心臟組織中CVB3病毒RNA數(shù)量和病毒滴度的改變。
　　二、Galectin-9對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響
　　由于galectin-9緩解VMC并沒有降低心肌病毒復(fù)制，我們進(jìn)一步探討了galectin-9治療對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響。結(jié)果顯示CVB3感染過程中，galectin-9可以顯著降低小鼠心臟和脾臟中CD4+T細(xì)胞的比例，同時(shí)增加Tregs、CD11b+及Gr-1

18、+細(xì)胞的數(shù)量。由于Tim-3(galectin-9特異性受體)和TLR4的相互作用在VMC的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，我們還檢測(cè)了galectin-9對(duì)Tim-3和TLR4在免疫細(xì)胞表面表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)galectin-9降低了CD4+T細(xì)胞Tim-3的表達(dá)，但其在巨噬細(xì)胞表面的表達(dá)顯著升高；同時(shí)galectin-9顯著降低了TLR4在CD11b+細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表面的表達(dá)。
　　上述結(jié)果提示，galectin-9緩解CVB3誘導(dǎo)的V

19、MC并不是直接降低病毒復(fù)制，而是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答參與心肌炎的發(fā)病，Tregs和CD11b+細(xì)胞可能參與其中。
　　前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，galectin-9可以有效的緩解CVB3誘導(dǎo)的VMC，我們進(jìn)一步探討了其可能的細(xì)胞學(xué)機(jī)制以及是否這種作用依賴于效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量的降低和Tregs數(shù)量的升高。
　　三、Galectin-9對(duì)于CD4+T細(xì)胞凋亡和增殖的影響
　　現(xiàn)有的研究表明，galectin-9可以優(yōu)先誘導(dǎo)效應(yīng)CD4

20、+T細(xì)胞的凋亡，而在CVB3誘導(dǎo)的VMC模型中，分泌IFN-γ的CD4+T cells是影響疾病嚴(yán)重性的重要因素。因此，我們首先檢測(cè)了galectin-9對(duì)CD4+T細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)galectin-9可以顯著促進(jìn)CD4+T細(xì)胞發(fā)生凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，galectin-9主要誘導(dǎo)CD4+CD25low/int效應(yīng)T細(xì)胞凋亡(>90％)，而對(duì)于CD4+CD25highTregs的促凋亡作用甚微(<10％)。我們同時(shí)也檢測(cè)了galec

21、tin-9對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)galectin-9能抑制CD4+T細(xì)胞增殖，并主要抑制CD4+CD25low/int效應(yīng)T細(xì)胞的增殖，而并不影響CD4+CD25high Tregs的增殖。Galectin-9差異調(diào)節(jié)Tregs和效應(yīng)T細(xì)胞凋亡和增殖可能是由于其受體Tim-3的表達(dá)差異造成的，相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
　　四、Galectin-9在誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化中的作用
　　Tregs在CVB3誘導(dǎo)的VMC的

22、發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。為了探討galectin-9是否影響Tregs應(yīng)答，我們檢測(cè)了galectin-9對(duì)Tregs分化的影響，發(fā)現(xiàn)galectin-9能促進(jìn)CVB3感染的裸鼠心臟和脾臟中CD4+CD25T細(xì)胞向Tregs轉(zhuǎn)化。
　　五、Galectin-9在擴(kuò)增CD11b+Gr-1+細(xì)胞中的作用
　　前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，galectin-9能顯著增加CD11b+和Gr-1+細(xì)胞的比例，而CD11b和Gr-1是髓系來源抑制

23、細(xì)胞(myeloid suppressor cells，MSCs)的特有表型，于是我們檢測(cè)了galectin-9在調(diào)節(jié)CD11b+Gr-1+細(xì)胞擴(kuò)增中的作用，結(jié)果顯示galectin-9能顯著擴(kuò)增CD11b+Gr-1+細(xì)胞。通過分析這群細(xì)胞的表型和細(xì)胞因子分泌情況，我們發(fā)現(xiàn)其具有髓系來源抑制細(xì)胞的表型。
　　許多研究表明，髓系來源抑制細(xì)胞可以促進(jìn)Tregs的擴(kuò)增。因此，我們接著研究了CD11b+Gr-1+細(xì)胞在擴(kuò)增Tregs中的作

24、用，結(jié)果顯示，CD11b+Gr-1+細(xì)胞可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞中Tregs的擴(kuò)增，這種作用部分依賴于IL-10，而不依賴于TGF-β。
　　綜上所述，本研究首次闡明了galectin-9在CVB3誘發(fā)的VMC發(fā)病中的作用；證實(shí)了galectin-9是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答參與了VMC的發(fā)病，并未影響病毒復(fù)制；多種機(jī)制參與了galectin-9對(duì)VMC的調(diào)節(jié)；Galectin-9差異調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞和Tregs增殖和凋亡；CD11b+G