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文檔簡(jiǎn)介
1、病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是由病毒感染所致的一種心肌炎癥性疾病。大部分的VMC可以完全康復(fù),但少部分進(jìn)展為擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)。目前VMC的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究表明T細(xì)胞在VMC的發(fā)病環(huán)節(jié)中扮演重要角色,其中Th1細(xì)胞在VMC急性期即出現(xiàn)顯著增高并分泌IFN-γ參與心肌炎癥反應(yīng),Th17細(xì)胞通過分泌IL-17加重心肌損傷和促進(jìn)纖維化。
調(diào)節(jié)性
2、B細(xì)胞(regulatory B cells,Bregs)是一類新發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)節(jié)性功能的B細(xì)胞。其中最重要的亞型是分泌IL-10B細(xì)胞(IL-10-producing B cells)。分泌IL-10B細(xì)胞通過IL-10,在細(xì)胞水平調(diào)節(jié)其他細(xì)胞,尤其是效應(yīng)性T細(xì)胞。已有的研究表明,調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在一些免疫炎癥性疾病中具有調(diào)節(jié)作用。然而,在VMC中,是否存在分泌IL-10B細(xì)胞,作用機(jī)制如何,目前尚未見報(bào)道。為此,本研究用柯薩奇病毒B3(C
3、oxsackievirus B3,CVB3)建立小鼠VMC模型,深入探索分泌IL-10B細(xì)胞在小鼠VMC發(fā)病中的作用及其機(jī)制,為VMC的治療尋求新靶點(diǎn)。本研究主要通過以下三部分進(jìn)行。
第一部分分泌IL-10B細(xì)胞在小鼠VMC發(fā)病過程中的變化
目的:探討分泌IL-10B細(xì)胞在VMC發(fā)病過程中的動(dòng)態(tài)變化,及其與Th1、Th17細(xì)胞和心肌病理等指標(biāo)的關(guān)系。
方法:4周齡BALB/c小鼠80只,隨機(jī)分為VMC組(n
4、=50)和對(duì)照組(n=30),兩組BALB/c小鼠均設(shè)1、2、4周3個(gè)時(shí)點(diǎn)亞組。CVB3腹腔注射建立小鼠 VMC模型,每個(gè)時(shí)點(diǎn)亞組小鼠分別為12只、18只、20只。腹腔注射PBS建立對(duì)照組,每個(gè)時(shí)點(diǎn)亞組小鼠均為10只。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)從兩組各取10只小鼠,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟分泌IL-10B細(xì)胞、CD1dhiCD5+B細(xì)胞、Th1細(xì)胞及Th17細(xì)胞,并且對(duì)心肌組織進(jìn)行HE染色觀察病理變化、計(jì)算心肌病理積分。
結(jié)果:
1、
5、VMC組心肌組織HE染色顯示,CVB3感染后1周出現(xiàn)心肌細(xì)胞局灶壞死和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn);第2周亞組心肌細(xì)胞壞死病灶增加、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多;第4周亞組未見心肌細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯。對(duì)照組各亞組心肌組織病理均正常。
2、VMC組心肌病理積分在1、2、4周亞組分別為2.30±0.48、2.90±0.74及1.40±0.52,與對(duì)照組各亞組(均為0)相比均顯著增高(P均<0.01),并且VMC組第2周亞組明顯高于第1周亞組(
6、P<0.05)及第4周亞組(P<0.01)。
3、VMC組各亞組脾臟分泌IL-10B細(xì)胞與對(duì)照組各亞組比較,1、2、4周亞組比例均明顯升高(2.70%±0.69% versus0.90%±0.36%;3.10%±0.50% versus1.18%±0.31%;1.37%±0.35% versus0.97%±0.21%。P均<0.01),并且VMC組第1、2周亞組均明顯高于第4周亞組(P均<0.01)。
4、VMC組各
7、亞組脾臟Th1細(xì)胞與對(duì)照組各亞組比較,1、2、4周亞組均顯著增高(6.62%±1.00% versus3.44%±1.34%;8.28%±2.04% versus3.52%±1.15%;5.61%±1.14% versus3.97%±1.01%。P均<0.01),并且VMC組第2周亞組明顯高于第1周亞組(P<0.05)及第4周亞組(P<0.01)。
5、VMC組各亞組脾臟Th17細(xì)胞與對(duì)照組各亞組相比,在1、2、4周亞組均顯著
8、增高(2.46%±0.50% versus0.98%±0.40%,P<0.05;5.35%±1.11% versus1.12%±0.51%,P<0.01;2.49%±0.48% versus0.98%±0.27%,P<0.01),并且VMC組第2周亞組明顯高于第1及第4周亞組(P均<0.01)。
6、與對(duì)照組各亞組比較,VMC組1、2、4周亞組脾臟CD1dhiCD5+B細(xì)胞均明顯增高(5.32%±1.20% versus2.1
9、0%±0.66%;5.56%±1.03%versus2.70%±0.63%;4.85%±1.02% versus2.85%±0.69%。P均<0.01),VMC組各亞組間無明顯差別(P均>0.05)。
結(jié)論:CVB3腹腔注射成功建立小鼠VMC模型;VMC小鼠的脾臟分泌IL-10B細(xì)胞在發(fā)病的1、2、4周均明顯增多,并且呈先高后低的變化趨勢(shì),而CD1dhiCD5+B細(xì)胞在發(fā)病過程中持續(xù)增多;VMC小鼠Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞在發(fā)
10、病的1、2、4周均明顯增多,并且第2周達(dá)高峰;伴隨VMC模型的心肌炎發(fā)生、發(fā)展及恢復(fù)的病理改變,小鼠的分泌IL-10B細(xì)胞、Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例有相應(yīng)平行動(dòng)態(tài)改變趨勢(shì)。
第二部分分泌IL-10B細(xì)胞對(duì)VMC小鼠Th1和Th17細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用
研究一、目的:探討過繼分泌IL-10B細(xì)胞對(duì)缺乏T和B細(xì)胞小鼠VMC的影響。方法:4周齡雄性BALB/c背景的SCID小鼠40只隨機(jī)分成干預(yù)組(n=20)和對(duì)照組(n=2
11、0)。CVB3感染SCID小鼠建立VMC模型。干預(yù)組CVB3感染SCID小鼠前1天,尾靜脈注射來源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B細(xì)胞。對(duì)照組注射生理鹽水作為陰性對(duì)照。觀察兩組小鼠的生存情況,并在第14天從每組中隨機(jī)選取8只小鼠,對(duì)心肌組織進(jìn)行HE染色觀察病理變化、計(jì)算心肌病理積分。
結(jié)果:
1、干預(yù)組心肌病理積分與對(duì)照組比較無明顯差別(3.28±0.28 versus3.47±0.24,P>0.05)。
12、 2、兩組的中位生存時(shí)間無差異(8.70d±0.57d versus7.93d±0.65d,P>0.05)。
結(jié)論:過繼分泌IL-10B細(xì)胞不能減輕缺T和B細(xì)胞的急性VMC小鼠的心肌組織的病理改變,也不能延長(zhǎng)VMC小鼠的生存時(shí)間,提示分泌IL-10B細(xì)胞在小鼠VMC發(fā)病中通過T細(xì)胞而起作用。
研究二、目的:探討過繼分泌IL-10B細(xì)胞對(duì)缺B細(xì)胞小鼠VMC的影響。
方法:SCID小鼠60只隨機(jī)分成3組:naǐ
13、ve組(n=20)、sensitized組(n=20)和contro1組(n=20)。尾靜脈注射CD4+T細(xì)胞同時(shí)腹腔注射CVB3建立一個(gè)缺乏B細(xì)胞的小鼠VMC模型。在VMC模型建立前1天,分別尾靜脈注射來源正常BALB/c小鼠(na(ǐ)ve組)、急性VMC BALB/c小鼠(sensitized組)的分泌IL-10B細(xì)胞,control組注射生理鹽水作為陰性對(duì)照。觀察3組小鼠14天的生存情況,并在第14天從各組中隨機(jī)選取10只小鼠,
14、HE染色觀察病理變化、計(jì)算心肌病理積分,RT-PCR檢測(cè)Th1轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Th17轉(zhuǎn)錄因子RORγ t的mRNA表達(dá)量,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟Th1和Th17細(xì)胞的比例。
結(jié)果:
1、與對(duì)照組比較,naǐve組的心肌病理積分無變化(2.12±1.07 versus2.87±0.85,P>0.05),而sensitized組心肌病理積分顯著減低(1.21±0.60 versus2.87±0.85,P<0.01)。<
15、br> 2、與對(duì)照組比較,naǐve組的中位生存時(shí)間無顯著差異(12.50d±0.70d versus11.05d±0.68d,P>0.05),而sensitized組中位生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(13.4d±0.24d versus11.05d±0.68d,P<0.05)。
3、與對(duì)照組比較,na(ǐ)ve組的VMC小鼠中脾臟Th1和Th17細(xì)胞的比例無變化(4.10%±1.74% versus5.83%±2.02%;2.24%±
16、1.34% versus2.92%±1.32%。P均>0.05),而sensitized組VMC小鼠脾臟Th1和Th17細(xì)胞的比例均顯著降低(3.20%±2.31% versus5.83%±2.02%,P<0.01;1.35%±1.24% versus2.92%±1.32%,P<0.05)。
4、與對(duì)照組比較,naǐve組心肌T-bet mRNA和RORγt的mRNA表達(dá)量均無明顯變化(3.76±1.49 versus4.62
17、±2.60;1.55±0.90 versus2.67±1.92。 P均>0.05),而sensitized組心肌T-bet和RORγ t的mRNA表達(dá)量均明顯降低(1.31±1.28 versus4.62±2.60,P<0.01;1.30±0.35 versus2.67±1.92,P<0.05)。
結(jié)論:免疫性過繼來源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B細(xì)胞可減輕缺B細(xì)胞小鼠的心肌炎病理改變、延長(zhǎng)生存時(shí)間,其機(jī)制主要通過下調(diào)T-
18、bet和RORγ t的mRNA轉(zhuǎn)錄而降低Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例;過繼來源于正常小鼠的分泌IL-10B細(xì)胞不能調(diào)節(jié)缺B細(xì)胞VMC小鼠的T-bet和RORγ t的mRNA轉(zhuǎn)錄以及Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的比例,因而缺B細(xì)胞VMC小鼠的心肌炎病理表現(xiàn)及生存時(shí)間也沒有受到影響。提示分泌IL-10B細(xì)胞通過下調(diào)T-bet和RORγ t的mRNA轉(zhuǎn)錄而降低Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例,從而抑制VMC小鼠心肌的炎癥損傷。
第三部分過繼
19、分泌IL-10B細(xì)胞對(duì)小鼠VMC發(fā)病過程的影響
目的:探討不同時(shí)點(diǎn)過繼分泌IL-10B細(xì)胞對(duì)VMC小鼠心肌損傷及預(yù)后的影響。
方法:4周齡BALB/c小鼠40只隨機(jī)分成干預(yù)組(n=20)和對(duì)照組(n=20)。CVB3感染BALB/c小鼠建立VMC模型。干預(yù)組分別于CVB3感染前1天,VMC第3天或第7天尾靜脈注射來源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B細(xì)胞。對(duì)照組尾靜脈注射生理鹽水。觀察兩組小鼠14天的生存情況并在第1
20、4天從每組中隨機(jī)選取10只小鼠,HE染色觀察病理變化、計(jì)算心肌病理積分,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟Th1和Th17細(xì)胞的比例。
結(jié)果:
1、與對(duì)照組比較,VMC模型建立前過繼分泌IL-10B細(xì)胞的干預(yù)組VMC小鼠的中位生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(13.80d±0.11d versus11.80d±0.62d,P<0.05),心肌病理積分明顯低于對(duì)照組(2.08±0.54 versus2.98±0.55,P<0.01),脾臟Th1和Th
21、17細(xì)胞的比例均顯著降低(4.57%±2.04%versus8.71%±2.29%;3.58%±0.57% versus5.36%±1.08%。P均<0.01)。
2、與對(duì)照組比較,VMC第3天過繼分泌IL-10B細(xì)胞的干預(yù)組不能延長(zhǎng)VMC小鼠中位生存時(shí)間(12.95d±0.37d versus11.75d±0.64d,P>0.05),但心肌病理積分明顯減低(2.08±0.54 versus2.94±0.30,P<0.01),
22、脾臟Th1和Th17細(xì)胞的比例均顯著降低(5.23%±1.94% versus8.17%±2.21%;3.35%±0.62% versus5.14%±1.20%,P均<0.01)。
3、與對(duì)照組比較,VMC第7天過繼分泌IL-10B細(xì)胞的干預(yù)組VMC小鼠的中位生存時(shí)間無顯著差異(12.55d±0.49d versus12.20d±0.57d,P>0.05),心肌病理積分無變化(2.47±0.66 versus3.01±0.56
23、,P>0.05),脾臟Th1和Th17細(xì)胞的比例亦無顯著差異(4.60%±1.97% versus6.27%±2.02%;4.03%±0.60%versus4.87%±1.18%。P均>0.05)。
結(jié)論:在CVB3建立小鼠VMC前過繼分泌IL-10B細(xì)胞可下調(diào)Th1和Th17細(xì)胞比例,從而減輕心肌炎癥損傷、延長(zhǎng)VMC小鼠的生存時(shí)間;VMC小鼠在發(fā)病的第3天過繼分泌IL-10B細(xì)胞可下調(diào)Th1和Th17細(xì)胞比例從而減輕心肌炎癥
24、損傷,但不能延長(zhǎng)生存時(shí)間;VMC小鼠在發(fā)病第7天過繼分泌IL-10B細(xì)胞不能下調(diào)Th1和Th17細(xì)胞比例,也不能改變心肌炎癥損傷及VMC小鼠生存時(shí)間。
本研究結(jié)果提示:
1、VMC小鼠的分泌IL-10B細(xì)胞在發(fā)病的1、2、4周均明顯增多,并且呈先高后低的變化趨勢(shì);伴隨VMC模型的心肌炎發(fā)生、發(fā)展及恢復(fù)的病理改變,小鼠的分泌IL-10B細(xì)胞、Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例有相應(yīng)平行動(dòng)態(tài)改變趨勢(shì)。
2、分泌IL-
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