K-ras基因在結直腸癌原發(fā)灶和對應肝轉移灶突變情況的對比研究.pdf

1、1.研究背景與目的
　　 結直腸癌是全世界的第三大常見腫瘤,每年新發(fā)病例超過1000000例。在美國,結直腸癌每年約有15.4萬新發(fā)病例及5.6萬患者死亡,占癌癥死因第2位。在我國,結直腸癌的發(fā)病率平均水平居全部惡性腫瘤的第4位,發(fā)病率每年遞增4.2％,而且發(fā)病年齡明顯提前,與20世紀70年代相比,在90年代城市的發(fā)病率上升了31.95％,農(nóng)村上升了8.51％。2006年中國衛(wèi)生統(tǒng)計提示大腸癌病死率位居惡性腫瘤第5位。據(jù)文獻報道

2、,肝是結直腸癰最常見的轉移部位。當結直腸癌確診時,已經(jīng)有20％-25％病例發(fā)生了肝轉移,而約60％的患者在其病程中會出現(xiàn)肝轉移。治愈性根治術后再發(fā)的肝轉移率為50％；結直腸癌死亡的患者肝轉移率高達45％～71％。雖然手術切除、局部消融及立體定向放射外科是常用的治療方法,但當原發(fā)灶不能切除或者肝功能不全時,內科治療仍然是確實有效的重要治療手段。
　　 目前,晚期結直腸癌的治療以化療為主,過去的40年里,5-氟尿嘧啶(5-FU)一直

3、是治療結直腸癌的主流藥物,隨后亞葉酸鈣(CF)的加入及5-FU持續(xù)泵注使CRC患者的生存明顯延長。20世紀90年代后期,新的細胞毒藥物奧沙利鉑(Oxaliplatin)、伊立替康(CPT-11)等問世,CRC的近期療效和生存期均得到顯著提高；近年來分子靶向藥物貝伐單抗(Avastin)、西妥昔單抗(Cetuximab)、帕尼單抗(Panitumumab)的出現(xiàn),使CRC的治療又上了一個新的臺階。
　　 表皮生長因子受體(EGFR

4、)是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體,目前發(fā)現(xiàn)該受體家族包括4個亞型:EGFR(HER1/ErbB1),HER2(ErbB2),HER3(ErbB3),HER4(ErbB4)。有超過10多種配體可以選擇性與EGFR單體結合。配體與受體結合后,引起受體的寡聚化作用,激活受體酪氨酸激酶,然后使得受體細胞內部分的酪氨酸殘基順式磷酸化。受體磷酸化后構象發(fā)生改變,形成停泊位點,以便與具有SH2(Src-homology 2)結構域和磷酸化酪氨酸結

5、合結構域的蛋白質結合,從而觸發(fā)包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)通路的信號傳導級聯(lián)反應,在器官形成和腫瘤生長過程中的細胞增生、抑制凋亡、血管生成和轉移擴散等方面發(fā)揮著很重要的作用。
　　 表皮生長因子受體(EGFR)在結直腸癌中有過量表達,為腫瘤治療提供了一個理想靶點。EGFR

6、過表達與細胞惡變、腫瘤細胞增侵襲、轉移、腫痛血管生成以及凋亡抗性密切相關。西妥昔單抗(Cetuximab)是一種重組人-鼠嵌合型IgG1型單克隆抗體,對細胞膜上的EGFR的親和力是內源性配基的5-10倍,與EGFR結合后,能阻止內源性配基與EGFR結合,切斷信號的傳導并阻斷酪氨酸激酶的磷酸化,從而抑制細胞周期進程、誘導腫瘤細胞凋亡、減少基質金屬蛋白酶和血管內皮生長因子的產(chǎn)生,還可引起受體的二聚化、內化和下調,抑制腫瘤浸潤和轉移。除了抑制

7、EGFR發(fā)揮抗腫瘤作用外,西妥昔單抗還能激活宿主的免疫反應,通過抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)殺傷腫瘤細胞。目前已證明用于伊立替康治療失敗的結直腸痛可提高療效。近期多項研究均表明:在轉移性結直腸痛中,K-ras野生型的患者接受西妥昔單抗聯(lián)合化療的療效、臨床獲益等均顯著優(yōu)于K-ras突變型組,強烈提示K-ras狀態(tài)與西妥昔單抗療效相關,是獨立的西妥昔單抗療效預測指標。只有K-ras野生型患者才建議接受EGFR抑制劑如西妥昔單抗和帕尼單抗

8、(包括單藥或與化療聯(lián)合)治療。因此,K-ras基因檢測被寫入2009年版《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(NCCN)結直腸痛臨床實踐指南》。也就是說,所有轉移性結直腸癌患者均應檢測K-ras基因狀態(tài)。
　　 目前認為,大腸癌的發(fā)生是機體內因(大腸癌的遺傳易感性)和外因(飲食和環(huán)境因素)共同作用的結果。大量實驗證明大腸癌的發(fā)生與多個癌基因的激活或抑癌基因的失活有關。Ras基因的突變被認為在癌變過程中起啟動作用并是一個早期事件。Ras基因最初

9、是在Kirston和Hayvey大鼠肉瘤中首先發(fā)現(xiàn)的,轉導了ras基因的鼠纖維細胞能發(fā)生惡性轉化,從而確定了其癌基因的地位。Ras基因家族由K-ras、H-ras和N-ras的三個密切相關的高度同源成員組成。Ras基因定位于人類的第12號染色體上,含有4個編碼外顯子和1個5’端非編碼外顯子,共同編碼含189個氨基酸組成的ras蛋白,因其相對分子質量為21×103,又稱為p21蛋白。K-ras的基因最常見的激活方式為點突變,突變主要發(fā)生在

10、1號外顯子的第12位密碼子上,偶也有發(fā)生于13位點及2號外顯子的61位點的。K-ras的基因12位密碼子野生型為甘氨酸,突變型常為半胱氨酸、纈氨酸、精氨酸三種,突變的結果導致編碼的氨基酸發(fā)生改變,從而產(chǎn)生具有致癌活性的p21蛋白。K-ras的基因發(fā)生異常時,鳥苷三磷酸酶(GTPase)活性降低,p21GTP牢固結合而不被GTPase水解,一直處于激活狀態(tài),持續(xù)刺激細胞生長、發(fā)育、增殖,引起細胞惡變,大腸癌即可發(fā)生。另外K-ras的基因激

11、活還可以通過擴增或過表達的方式,但發(fā)生頻率較低,多數(shù)在動物實驗中發(fā)現(xiàn)。Algar等研究認為,K-ras的基因過表達,明顯降低自然殺傷細胞(NK細胞)對腫瘤的殺傷作用,是大腸癌轉移,病情進展的特征。經(jīng)研究認為,K-ras的基因突變是在腫瘤早期形成過程中即已發(fā)生,K-ras的基因突變更賦予腫瘤極大的浸潤與轉移傾向的可能。
　　 大腸癌K-ras基因突變率在歐美約為30％-68％,而臺灣、日本人的K-ras突變率為26.5％-36.9

12、％,較歐美的檢出率偏低。Oliveira等發(fā)現(xiàn)K-ras基因的突變率在結直腸癌的淋巴結轉移灶中比相應的原發(fā)灶高；而Molinari等報道K-ras基因在30例結直腸癌原發(fā)灶和相關轉移灶的突變情況,有26例表達一致,一致率為86.6％；Daniele等分析99例結直腸癌原發(fā)灶和相關轉移灶的K-ras基因突變情況,其一致率96.0％；Fotios等研究43例結直腸痛原發(fā)灶和相關轉移灶的K-ras基因突變情況,一致率為95.0％。然而,原發(fā)灶

13、K-ras基因突變情況可否作為對應肝轉移灶突變情況的預測呢?上述國外這方面的報道的研究結果不盡相同,而目前國內缺乏相關的資料。本研究觀察了75例結直腸癌肝轉移的原發(fā)灶和對應肝轉移灶中K-ras基因的突變情況,比較兩者的一致性,為選用分子靶向藥物提供新的依據(jù)。
　　 2.研究方法
　　 收集2003年1月1日至2008年5月30日佛山市第一人民醫(yī)院同期或二期手術切除所得的結直腸癌及對應的肝轉移灶病理標本75例。獲取病理標木

14、時,所有患者均未接受任何分子靶向藥物治療。所有標本經(jīng)常規(guī)福爾馬林固定、石蠟包埋,切成10μm厚的切片置于玻片上,應用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit組織盒分別提取腸癌組織及對應的肝轉移灶組織的DNA。提取的DNA經(jīng)常規(guī)PCR反應擴增K-ras基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳純化鑒定后經(jīng)過DNA測序儀進行測序。采用直接測序法分別檢測原發(fā)灶組織和對應肝轉移灶組織中K-ras基因(主要檢測第12位及第13位密碼子)的突

15、變情況。數(shù)據(jù)結果以率表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行配對x2檢驗,檢驗水準a=0.05。
　　 3.結論
　　 3.1.本研究中,原發(fā)灶K-ras基因突變率為33.3％,與亞洲的報道相近；而12密碼子的突變的主要類型為G12D(GGT→GNT)和G12V(GGT→GTT),與上述報道的相似。
　　 3.2.本研究中,原發(fā)灶與對應肝轉移灶痛組織中K-ras基因表達情況的一致率為93.1％。因此,我們認為,對于

16、中國人來說,在轉移性結直腸痛中,原發(fā)灶和對應轉移灶的K-ras基因突變是基本一致的,原發(fā)灶K-ras的狀態(tài)可以指導臨床用藥,轉移灶不一定要重取活檢,或如原發(fā)灶的標本無法獲取時,亦可取轉移灶的病理標本進行K-ras基因狀態(tài)檢測。這樣可以減少重復的醫(yī)療操作,減少并發(fā)癥,節(jié)省時間,降低醫(yī)療成本。
　　 3.3.當然,要獲得更準確的資料,需要更大樣本的研究以及相關蛋白表達情況的檢測和臨床病例的隨訪分析等,我們提供的這個初步研究資料希望對