中國部分地區(qū)鮑曼不動桿菌多位點序列分型及碳青霉烯類抗生素耐藥機制研究.pdf

1、碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌(Carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)在我國各地的廣泛出現和流行，給臨床治療帶來了極大的困難。應用分子分型技術對我國各個地區(qū)的CRAB進行系統全面的分子流行病學研究，闡明我國CRAB的流行分布情況，將為制訂科學、有效的預防和控制措施提供理論依據。
　　 本研究第一部分收集了2005年中國16個城市24家三級醫(yī)院的分離的226株非重復的鮑曼

2、不動桿菌，包括152株CRAB菌株和74株碳青霉烯類抗生素敏感鮑曼不動桿菌(Carbapenem-susceptibleAcinetobacterbaumannii，CSAB)，應用多位點序列分型(Multilocussequencetyping，MLST)技術對這些菌株進行分子分型，并將結果與細菌分子分型技術的“金標準”脈沖場凝膠電泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)結果進行比較，分析MLST技

3、術應用于鮑曼不動桿菌分子流行病研究的可行性；應用eBURST軟件對MLST數據進行分析，推測菌株的進化關系，并與國外鮑曼不動桿菌MLST分型結果進行比較分析；測定了11種抗菌藥物的體外敏感性試驗；應用PCR檢測了菌株攜帶的碳青霉烯類抗生素耐藥基因。
　　 MLST結果顯示，CRAB菌株的遺傳背景相對單一，包含8個序列型(Sequencetype，ST)，其中ST92及其單個位點變異型(Singlelocusvariant，SLV

4、)ST90和ST75為主要流行ST型，其次為ST91型。CSAB菌株具有更多樣性的遺傳背景，包含36個ST型，ST92也是CSAB菌株中最主要的ST型。
　　 PFGE將226株鮑曼不動桿菌分為44個脈沖型。整體上看，PFGE與MLST的結果具有較好的一致性，但是在對ST92及其SLVs菌株的區(qū)分上，PFGE和MLST存在部分的差異。與PFGE相比，MLST對菌株同源性的判定更為保守，可以反映菌株較長時間內的進化關系。
　

5、　 將MLST數據與鮑曼不動桿菌網絡數據庫Pubmlst(http://pubmlst.org/abaumannii/)中數據進行對比分析，發(fā)現ST92及其SLVs屬于克隆復合體92(Clonalcomplex92，CC92，原名CC22)，是目前數據庫中最主要克隆復合體，其菌株來源包括了亞洲、歐洲、大洋洲和美洲的多個國家，證實CC92存在世界性的廣泛流行，且中國流行的CRAB菌株與國外流行的菌株在進化上來自于相同的祖先。
　　

6、 CC92和ST91型鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類、第三和第四代頭孢菌素、氨基糖苷類、米諾環(huán)素和氟喹諾酮的耐藥性均要高于其他ST型鮑曼不動桿菌(P<0.001)。ST92-CRAB與ST92-CSAB相比，除碳青霉烯類抗生素以外，對以上其他抗菌藥物的耐藥率無統計學差異，提示多重耐藥是ST92型菌株的重要特征。
　　 blaOXA-23是CRAB菌株攜帶的最主要的獲得性的碳青霉烯酶基因。ST91型CRAB菌株同時攜帶了blaOXA-

7、23和blaOXA-58。CSAB菌株中均未檢測到獲得性的碳青霉烯酶基因。blaOXA-23陽性的ST92型CRAB菌株對亞胺培南的最小抑菌濃度(Minimalinhibitoryconcentration，MIC)是blaOXA-23陰性的ST92型CSAB菌株的32-128倍，提示blaOXA-23是造成ST92型鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的關鍵因素。
　　 本研究第一部分應用了MLST分型技術對國內多個城市的鮑曼不

8、動桿菌進行分子流行病學研究，發(fā)現克隆復合體CC92是我國甚至全球流行范圍最廣的CRAB克隆，且具有很強的耐藥性。OXA-23型碳青霉烯酶基因是介導CC92對該類抗生素耐藥的重要因素。CC92在國內的出現和播散是我國鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥率不斷升高的重要原因。
　　 具有碳青霉烯類抗生素水解能力的D類β-內酰胺酶(CarbapenemhydrolyzingclassDβ-lactamase，CHDL)是介導鮑曼不動桿菌

9、對碳青霉烯類抗生素耐藥的最重要機制。blaOXA-58是一種呈全球分布的CHDL基因。本研究第一部分發(fā)現ST91型CRAB同時攜帶了blaOXA-23型和blaOXA-58型碳青霉烯酶基因。第二部分在此基礎上，對攜帶blaOXA-58基因的不動桿菌的遺傳背景特征、質粒特征及blaOXA-58基因的周圍結構與耐藥表型間的聯系進行了深入研究。
　　 第二部分研究收集了13株攜帶blaOXA-58基因的非重復的不動桿菌，來自自國內6個

10、城市的7家三級醫(yī)院，包括了2株pittii不動桿菌(即不動桿菌基因種型3)，3株nosocomialis不動桿菌(即不動桿菌基因種型13TU)和8株鮑曼不動桿菌(其中兩株浙江金華的鮑曼不動桿菌來自在第一部分研究)。應用PFGE和MLST對這些菌株進行分子流行病學研究；測定所有菌株對13種抗菌藥物的MIC值；應用Southern雜交確定blaOXA-58的基因定位；應用質粒抽提和電轉化確定攜帶blaOXA-58質粒的可傳播性；應用限制性酶

11、切、克隆技術分析blaOXA-58的基因周圍序列；應用基于PCR的鮑曼不動桿菌質粒復制子分型法(AcinetobacterbaumanniiPCR-basedreplicontyping，AB-PBRT)對不同菌株中攜帶blaOXA-58的質粒進行分型研究。
　　 PFGE分型發(fā)現，2株pittii不動桿菌屬于同一個脈沖型(分別來自浙江杭州和浙江臺州)，3株nosocomialis不動桿菌分屬于2個脈沖型(均來自浙江溫州)，8株

12、鮑曼不動桿菌可分為3個脈沖型。8株鮑曼不動桿菌可分為3個ST型。其中，ST91在浙江金華和湖北武漢的醫(yī)院出現，且浙江金華中心醫(yī)院2004年和2009年均分離到了ST91型產OXA-58型碳青霉烯酶的鮑曼不動桿菌，提示其存在地方性流行。
　　 13株不動桿菌表現出不同的碳青霉烯類抗生素敏感性表型。pittii不動桿菌和nosocomialis不動桿菌均為碳青霉烯類抗生素敏感。而鮑曼不動桿菌中僅有一株為碳青霉烯類抗生素敏感，其余均為

13、耐藥。同時，鮑曼不動桿菌對第三代和四代頭孢菌素、含β-內酰胺酶抑制劑的復合制劑、氨基糖苷類、米諾環(huán)素和環(huán)丙沙星的耐藥性均要高于pittii不動桿菌和nosocomialis不動桿菌。
　　 Southern雜交結果顯示，13株不動桿菌中blaOXA-58基因均定位于質粒上，質粒大小范圍在52kb～305kb之間。除了305kb的質粒外，其余質粒均可通過電轉化轉移到碳青霉烯類抗生素敏感的鮑曼不動桿菌受體菌中。應用AB-PBRT分型

14、法發(fā)現，這些質粒不屬于已知的質粒復制子分型。確認了2株pittii不動桿菌，3株nosocomialis不動桿菌和2株鮑曼不動桿菌中攜帶blaOXA-58基因的質粒屬于一種新的質粒復制子分型，命名為Aci10。
　　 對blaOXA-58基因的周圍序列進行分析發(fā)現，在blaOXA-58基因的上游存在類似插入序列(Insertionsequence，IS)ISAba3的ISAba3-like結構。部分菌株的ISAba3-like結

15、構被IS6家族的插入序列打斷，形成IS6family-△ISAba3-like-blaOXA-58的特殊結構。該結構僅出現在7株碳青霉烯類抗生素耐藥的鮑曼不動桿菌和1株碳青霉烯類抗生素敏感的nosocomialis不動桿菌中，且具有此結構的質粒通過電轉化轉入鮑曼不動桿菌受體菌后介導了受體菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥或中介。其余碳青霉類抗生素敏感的不動桿菌中blaOXA-58基因的上游的ISAba3-like結構未被其他IS序列打斷。啟動子

16、分析發(fā)現，IS6family-△ISAba3-like結構為下游blaOXA-58的表達提供了強啟動子，在介導碳青霉烯類抗生素耐藥中起了重要作用。部分菌株blaOXA-58基因的周圍序列中發(fā)現了重組位點序列，提示blaOXA-58基因的轉移可能和重組事件有關。ST91型鮑曼不動桿菌blaOXA-58基因的下游同時發(fā)現了攜帶氨基糖苷類磷酸轉移酶基因aphA6的復合轉座子TnaphA6。aphA6隨blaOXA-58基因進行傳播使受體菌同時

17、獲得對碳青霉烯類抗生素和氨基糖苷類抗生素的耐藥能力。
　　 本研究第二部分發(fā)現blaOXA-58基因可存在于pittii不動桿菌、nosocomialis不動桿菌和鮑曼不動桿菌中，且均定位于質粒上，可以通過電轉化的方式轉移到受體菌中。pittii不動桿菌、nosocomialis不動桿菌和部分鮑曼不動桿菌中攜帶blaOXA-58基因的質粒具有相同的質粒復制子分型，提示質粒在不動桿菌間的傳播也是造成鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐