腮腺炎病毒F蛋白七肽重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、腮腺炎病毒(MuV)同其他囊膜病毒相似,在融合蛋白(F)中具有兩個(gè)七肽重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(HR).有關(guān)其他囊膜病毒F蛋白的研究表明,HR區(qū)在F蛋白介導(dǎo)的病毒侵染中起著至關(guān)重要的作用,在結(jié)合蛋白或結(jié)合亞基的協(xié)助作用下,兩段HR結(jié)構(gòu)域的構(gòu)像發(fā)生變化形成熱穩(wěn)定的富含α螺旋的發(fā)夾異源三聚體結(jié)構(gòu),并由此得到一個(gè)共同的融合機(jī)制.但目前并不清楚MuV是否有類似于其他囊膜病毒的侵染機(jī)制.該研究構(gòu)建了HR區(qū)(HR1、HR2和2-Helix)的重組載體,并在大

2、腸桿菌中以融合蛋白的形式表達(dá)了HR1、HR2和2-He1ix.GST融合的HR1、HR2和2-Helix單體蛋白都以可溶形式表達(dá),利用親和層析及凝膠過濾層析純化獲得了高純度的目的蛋白.經(jīng)pull-down實(shí)驗(yàn),初步證實(shí)HR1和HR2之間存在相互作用,HR1和HR2的混合物在凝膠過濾層析中以聚體形式存在.HR1/HR2和2-Helix的化學(xué)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)表明,等摩爾的HR1和HR2可形成異源三聚體,其中2-Helix蛋白隨著交聯(lián)劑濃度的增加,呈

3、現(xiàn)明顯的單體和聚體的濃度梯度;HR1/HR2蛋白由于濃度較低雖未見清晰的單體和聚體的濃度梯度,但仍可看到明顯的異源三聚體.凝膠過濾層析也證實(shí)了這一結(jié)果,兩者在同一位置出峰,且在分子量為52 kDa和14.4 kDa的出峰位置之間,顯示其以聚體形式存在.質(zhì)譜分析結(jié)果顯示,2-Helix蛋白分子量為11.7 kDa,HR1為7.1 kDa,HR2為4.7 kDa,2-Helix和HR1/HR2三體分子量分別為35.1 kDa和35.4 kD

4、a,與凝膠過濾層析結(jié)果相對應(yīng).圓二色譜分析結(jié)果表明,單獨(dú)的HR1以α螺旋結(jié)構(gòu)存在,而HR2則以無規(guī)卷曲存在,當(dāng)兩者等摩爾混合后,α螺旋含量明顯增加.2-Helix同樣具有典型的α螺旋結(jié)構(gòu).2-Helix和HR1/HR2三體相當(dāng)穩(wěn)定,Tm達(dá)到76℃,而且這種結(jié)合是特異的,高溫變性后的蛋白經(jīng)低溫長時(shí)間放置后能夠大部分復(fù)性,仍然呈現(xiàn)較高含量的α螺旋結(jié)構(gòu).用晶體生長條件篩選試劑盒(Crystal Screen Ⅰ and Ⅱ,Hampton R

5、esearch,Riverside,CA,USA)對2-Helix蛋白晶體的生長條件進(jìn)行初選,經(jīng)過優(yōu)化最后在15%PEG 8000、1.0 M Li<,2>SO<,4>緩沖液長出可以進(jìn)行衍射的晶體.通過應(yīng)用程序AMORE,以SV5 F蛋白N1/C1三聚體晶體結(jié)構(gòu)(PDB code:1SVF)為模型,利用分子置換的方法對2-Helix的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,得到了與SV5、RSV和NDV核心結(jié)構(gòu)相似的六螺旋束,顯示MuV可能具有與上述蛋白相似