葉酸-白蛋白-多柔比星的制備及其抗腫瘤性質(zhì)研究.pdf

1、在臨床上對于癌癥的治療，藥物的傳統(tǒng)給藥方式已經(jīng)顯得比較低效，另外，化療因難以忍受的各種不良反應(yīng)使得其臨床應(yīng)用率大大受到限制，因此，抗腫瘤藥物特定傳送已經(jīng)逐漸成為一個吸引人的癌癥治療方法。尋找有效的藥物靶向投遞系統(tǒng)，是腫瘤生物治療的研究熱點之一。葉酸受體介導(dǎo)的藥物投遞系統(tǒng)利用葉酸受體在一些腫瘤組織高水平表達葉酸受體，在正常組織中不表達或低表達，通過葉酸受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將所攜帶的藥物靶向轉(zhuǎn)運到特定的組織和細胞，具有高特異性、高親和力的特點

2、，大大提高了藥物轉(zhuǎn)運效率。目前,腫瘤細胞葉酸受體受到廣泛關(guān)注，已成為腫瘤診斷和治療研究的新靶點。腫瘤細胞表面的葉酸受體及葉酸受體介導(dǎo)的葉酸高分子復(fù)合物的腫瘤靶向性是本研究的主題。
　　 本論文設(shè)計了一種葉酸－牛血清白蛋白－多柔比星（即Folate-BSA-DOX）三元靶向給藥體系，其中，由于葉酸和多柔比星能同時結(jié)合于牛血清白蛋白的不同位點而被牛血清白蛋白運輸?shù)襟w內(nèi)，再利用葉酸與其受體的特異性結(jié)合而使腫瘤細胞更有效地攝取多柔比星。

3、紫外吸收光譜證實了Folate-BSA-DOX三元體系的形成。而且，細胞凋亡試驗顯示偶聯(lián)了葉酸的Folate-BSA-DOX三元體系的48小時細胞調(diào)亡率達到38.8％，比未偶聯(lián)葉酸的BSA-DOX二元體系高出70％。本研究證明：葉酸－牛血清白蛋白－多柔比星三元靶向給藥體系是可行的也是有效的。本研究的主要內(nèi)容包括:
　　 利用經(jīng)典的過碘酸鈉氧化反應(yīng)，把多柔比星上的羥基氧化成醛基，白蛋白上的游離功能氨基通過許夫堿結(jié)合到多柔比星的醛基

4、上，合成了BSA-DOX.通過紫外掃描圖可以清楚地證明BSA-DOX成功地合成，葉酸受體在多種腫瘤細胞表面高表達的特點，使其具有主動靶向作用，以期望提高BSA-DOX對腫瘤細胞攝取量。利用雙功能偶聯(lián)劑1-(3-二甲基-氨丙基)-3-乙基碳二亞胺（EDC）將葉酸通過葉酸活性酯的方式與BSA-DOX 偶聯(lián)。通過葡聚糖凝膠柱色譜法可以清楚地看到葉酸-白蛋白-多柔比星與未反應(yīng)的葉酸活性酯完全分離，同時用紫外進行監(jiān)測洗脫，純化的葉酸-白蛋白-多柔

5、比星與葉酸、白蛋白、多柔比星機械混合的洗脫曲線說明葉酸己經(jīng)成功地偶聯(lián)于BSA-DOX上。對反應(yīng)時間、pH和葉酸活性酯用量等因素進行了單因素考察，確定了最佳的偶聯(lián)工藝,反應(yīng)時間為1小時、pH為9.8和葉酸活性酯用量在30mg時偶聯(lián)比較高。并且定量測定了偶聯(lián)物中葉酸、多柔比星對BSA的偶聯(lián)率。
　　 以葉酸受體陽性的人宮頸癌細胞Hela為模型細胞，通過倒置熒光顯微鏡定性觀察，研究了Hela細胞對葉酸-白蛋白-多柔比星的特異性攝取作用

6、，并從給藥濃度、給藥時間和偶聯(lián)比不同三個方面考察了葉酸-白蛋白-多柔比星對其攝取作用的影響,在細胞攝取的影響因素實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長、給藥濃度的增大，Hela細胞中的熒光強度增強了。運用流式細胞術(shù)(FCM)定量檢測葉酸受體陽性細胞對葉酸-白蛋白-多柔比星的攝取作用，進一步證明了偶聯(lián)了葉酸的聚合物對葉酸受體陽性細胞的靶向作用。同時通過流式細胞術(shù)檢測了葉酸-白蛋白-多柔比星誘導(dǎo)Hela細胞的細胞凋亡率。分別給藥12、24、48小時