納米金和鹽酸多柔比星雙載溫敏凝膠用于腫瘤放化療的研究.pdf

1、腫瘤嚴(yán)重威脅著人類健康，將放療和化療聯(lián)合應(yīng)用的放化療治療是臨床常用的腫瘤綜合治療策略之一。近年來，研究新型放化療治療策略以提高腫瘤放化療治療效果是腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。其中，新型放射增敏劑的研究為研究新型放化療治療策略提供了新契機(jī)。
　　在諸多新型放射增敏劑中，納米金因其獨(dú)特優(yōu)勢脫穎而出。納米金作為新型放射增敏劑，具有生物相容性良好、反應(yīng)惰性、合成路線簡單和表面易修飾等優(yōu)勢?；谀[瘤綜合治療的理念，將納米金這一新型放射增敏劑與化療藥

2、物聯(lián)用，作為新型放化療治療策略成為目前的研究焦點(diǎn)。
　　鹽酸多柔比星(Doxorubicin，DOX)是一種廣譜抗腫瘤藥物，臨床可用于急性白血病、惡性淋巴瘤、乳腺癌和肺癌等腫瘤的治療。作為蒽環(huán)類拓?fù)洚悩?gòu)酶-Ⅱ抑制劑，DOX可嵌合于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，阻止DNA復(fù)制，干擾mRNA轉(zhuǎn)錄，最終抑制蛋白表達(dá)。DOX抗腫瘤作用機(jī)制明確，臨床應(yīng)用廣泛，因此本課題以DOX作為模型化療藥物，將其與新型放射增敏劑納米金聯(lián)用，探究該聯(lián)用策略對腫瘤放化

3、療治療的增強(qiáng)效果。
　　近年來，將DOX用于黑色素瘤的研究取得了一定成果。黑色素瘤是死亡率最高的皮膚癌之一，其初始癥狀不明顯，患者確診時(shí)腫瘤細(xì)胞往往已侵襲至皮膚深層。在對侵襲較深的黑色素瘤臨床治療策略中，放化療占據(jù)重要地位，因而對增強(qiáng)黑色素瘤放化療治療效果的探究越來越受到研究學(xué)者的重視。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)發(fā)布的黑色素瘤治療指南指出，瘤內(nèi)給藥是

4、臨床治療黑色素瘤的重要給藥途徑之一。瘤內(nèi)給藥具有提高瘤內(nèi)藥物分布，增強(qiáng)腫瘤治療效果等優(yōu)勢。因此，采用瘤內(nèi)給藥方式，探究新型治療策略用于增強(qiáng)黑色素瘤放化療效果，具有科學(xué)研究價(jià)值和臨床應(yīng)用潛力。
　　近年來，溫敏凝膠作為瘤內(nèi)給藥劑型受到廣泛關(guān)注。溫敏凝膠作為瘤內(nèi)給藥劑型具有以下優(yōu)勢:在室溫或低溫時(shí)呈液體狀態(tài)，方便給藥;在體溫時(shí)呈凝膠狀態(tài)，可緩慢釋放藥物，延長藥物局部滯留時(shí)間。普朗尼克F127(Pluronic(@)F127,F127)

5、是一種常見的嵌段共聚物溫敏凝膠基質(zhì)。作為FDA批準(zhǔn)的藥用輔料，F(xiàn)127用作溫敏凝膠基質(zhì)具有安全性高，價(jià)格低廉和生物相容性好等優(yōu)勢。因此，對F127溫敏凝膠制劑的研究具有重要科學(xué)意義。
　　為提高腫瘤放化療效果，本課題提出創(chuàng)新性聯(lián)用策略:將新型放射增敏劑納米金和DOX聯(lián)合用于腫瘤放化療。為實(shí)現(xiàn)黑色素瘤的瘤內(nèi)給藥，延長納米金和DOX在黑色素瘤內(nèi)的滯留時(shí)間，本課題構(gòu)建了基于F127的溫敏凝膠制劑并共載納米金和DOX，通過瘤內(nèi)注射方式給藥

6、，最終增強(qiáng)對黑色素瘤的放化療治療效果。本課題主要研究方法和結(jié)果如下:
　　1.采用檸檬酸鈉還原氯金酸，成功合成了納米金，并對其表面進(jìn)行了PEG修飾，所得PEG修飾納米金(AuNPs)在524nm波長處有最大吸收。采用紫外分光光度計(jì)，建立了DOX在pH6.8和pH7.4條件下體外含量測定方法，DOX濃度在0.5～100μg/mL范圍內(nèi)符合測定要求。
　　2.采用冷溶法制備了空白、單載和雙載溫敏凝膠制劑。以膠凝溫度、膠凝時(shí)間和通

7、針性為指標(biāo)對處方進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最優(yōu)處方:濃度為22％的F127,分別含DOX0.5 mg/mL和AuNPs1 mg/mL，膠凝溫度為27.2±0.3℃，膠凝時(shí)間為170±9s，在20℃及以下時(shí)通針性良好。對AuNPs溶液和雙載溫敏凝膠制劑的微觀形態(tài)、粒徑和zeta電位進(jìn)行了考察和比較，結(jié)果顯示AuNPs溶液和雙載溫敏凝膠制劑中納米金微觀形態(tài)均勻圓整，粒徑大小為13.09±1.77 nm，AuNPs溶液zeta電位為-13.5±2.9

8、3 mV，雙載制劑zeta電位為-14.9±2.20 mV。采用椎板法對雙載溫敏凝膠制劑流變學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了考察，在剪切速率恒定時(shí)，溫敏凝膠制劑的粘度在10℃至27.5℃之間隨溫度升高而逐漸增大，在27.5℃之后粘度趨于穩(wěn)定狀態(tài)，表明了AuNPs和DOX雙載溫敏凝膠制劑的溫度敏感性;在制劑處于體溫37℃時(shí)，其剪切應(yīng)力均隨剪切速率的增加而增大，其粘度均隨剪切速率的增加而減小，表明AuNPs和DOX雙載溫敏凝膠處于凝膠狀態(tài)時(shí)表現(xiàn)為假塑性流體。采

9、用動態(tài)膜透析法測定了DOX的體外釋放行為，水溶液對照組的DOX累積釋放在8h時(shí)達(dá)到頂峰，高于凝膠制劑組在8h時(shí)的累積釋放(p＜0.05)，驗(yàn)證了雙載溫敏凝膠制劑對DOX的緩釋。
　　3.采用MTT法測定了AuNPs和DOX在肝癌細(xì)胞HepG2和黑色素瘤細(xì)胞B16上的細(xì)胞毒性和IC50值。本課題所用AuNPs濃度范圍內(nèi)細(xì)胞存活率均大于80％，表明AuNPs濃度在1～20 nM時(shí)細(xì)胞安全性良好;DOX在HepG2和B16細(xì)胞上的IC5

10、0值分別為4.20±0.66和0.21±0.05μM。采用ICP-AES對HepG2和B16細(xì)胞的AuNPs攝取進(jìn)行了測定。HepG2細(xì)胞對納米金攝取量達(dá)峰時(shí)間為36h，與24 h時(shí)攝取量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);B16細(xì)胞對納米金攝取量達(dá)峰時(shí)間為24 h。因此，設(shè)定AuNPs孵育后24 h給予X射線照射。分別采用MTT法和克隆形成試驗(yàn)驗(yàn)證了在6 MvX射線照射下AuNPs對HepG2和B16細(xì)胞的射線增敏作用，考察了AuNPs與D

11、OX聯(lián)用對HepG2和B16細(xì)胞殺傷的增強(qiáng)作用，結(jié)果表明:AuNPs存在時(shí)，X射線對HepG2和B16細(xì)胞的殺傷作用大于射線對照組(p＜0.05)，驗(yàn)證了AuNPs的X射線增敏作用;AuNPs和DOX聯(lián)用組比單獨(dú)用藥組對HepG2和B16細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)(p＜0.05)，驗(yàn)證了聯(lián)用的優(yōu)越性。
　　4.分別采用抑瘤試驗(yàn)和組織切片Ki-67染色驗(yàn)證了AuNPs在小鼠黑色素瘤模型中對6MvX射線的增敏作用及其與DOX聯(lián)用優(yōu)勢。結(jié)果表明

12、:AuNPs在無X射線照射下與生理鹽水組腫瘤體積變化類似(p＞0.05)，說明AuNPs自身無抗腫瘤活性;在X射線照射下AuNPs組腫瘤體積小于射線照射組(p＜0.05)，驗(yàn)證了AuNPs的X射線增敏效果;在X射線照射下AuNPs和DOX雙載制劑的腫瘤體積顯著小于單載制劑組(p＜0.01)，驗(yàn)證了雙載制劑對B16荷瘤小鼠的抑瘤效果優(yōu)于單載制劑;在X射線照射下AuNPs和DOX雙載制劑的腫瘤體積顯著小于混合溶液組(p＜0.01)，驗(yàn)證了溫

13、敏凝膠制劑對B16荷瘤小鼠的抑瘤效果優(yōu)于混合溶液組。分別測定了DOX和AuNPs的瘤內(nèi)滯留量，考察了小鼠腫瘤內(nèi)DOX和金元素(Au)的滯留效應(yīng)。結(jié)果顯示:在所測時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，水溶液組DOX瘤內(nèi)滯留率顯著低于溫敏凝膠組(p＜0.01)，水溶液組給藥后8h瘤內(nèi)DOX滯留率降為33.7±4.6％，溫敏凝膠組給藥后24 h和48h瘤內(nèi)滯留率分別為58.7±6.6％和15.7±2.1％;溫敏凝膠組和溶液組給藥后48 h兩者的AuNPs瘤內(nèi)滯留率分別為

14、35.8±3.42％和14.2±3.43％。說明了雙載溫敏凝膠制劑相比于水溶液制劑對DOX和AuNPs瘤內(nèi)滯留具有延長效果。通過測定小鼠體重變化，單載AuNPs溫敏凝膠的大鼠皮膚急性刺激性試驗(yàn)和小鼠主要器官組織切片H&E染色評價(jià)了本課題所制備制劑對小鼠體重、大鼠背部皮膚和小鼠主要組織器官的損傷，結(jié)果顯示三項(xiàng)試驗(yàn)中均未觀察到明顯損傷跡象，驗(yàn)證了本課題所制備制劑對小鼠體重、大鼠背部皮膚和小鼠主要組織器官無明顯損傷作用。
　　綜上所述，

15、本課題合成了納米金并完成了PEG對其表面的修飾，構(gòu)建了共載AuNPs和DOX的F127溫敏凝膠制劑。本課題所制備共載AuNPs和DOX的溫敏凝膠制劑具有溫度敏感性，制劑中DOX的體外釋放具有緩釋性，制劑中AuNPs和DOX的瘤內(nèi)滯留時(shí)間均得到延長，在小鼠黑色素瘤模型上對黑色素瘤放化療治療效果有增強(qiáng)作用。本課題將新型放射增敏劑納米金和DOX共載于F127溫敏凝膠制劑中，通過瘤內(nèi)給藥，增強(qiáng)了對黑色素瘤的放化療治療效果，為臨床實(shí)現(xiàn)放射增敏劑和