丹皮酚增強(qiáng)表柔比星抗腫瘤活性、降低其毒性的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)主要探討丹皮酚是否能增強(qiáng)表柔比星的抗乳腺癌活性及其具體的作用機(jī)制，是否能減輕表柔比星誘導(dǎo)的心臟、肝臟和腎臟毒性及其具體作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.丹皮酚增強(qiáng)表柔比星體外抗乳腺癌活性的研究
　　選用小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1及人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，MTT法檢測不同濃度的丹皮酚或/和表柔比星對乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，計(jì)算出聯(lián)合用藥指數(shù)，評價聯(lián)合用藥效果。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法、

2、Hochest33258檢測丹皮酚或/和表柔比星對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響。Western blotting法檢測丹皮酚或/和表柔比星對凋亡蛋白cleaved PARP，cleaved caspase-3，Bax和Bcl-2表達(dá)的影響。最后檢測p38/ERK/JNK MAPKs通路中主要蛋白的表達(dá)，探討丹皮酚或/和表柔比星抑制乳腺癌細(xì)胞增殖可能介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　2.丹皮酚增強(qiáng)表柔比星體內(nèi)抗乳腺癌活性的研究
　　選Balb

3、/c小鼠第四對右側(cè)乳腺注射4T1癌細(xì)胞，建立小鼠原位乳腺癌模型。待腫瘤長到約100 mm3時，給予丹皮酚(200 mg/kg)灌胃或/和表柔比星(2.5 mg/kg)尾靜脈注射，兩天一次，共八次。每次給藥后測量腫瘤長和寬，計(jì)算腫瘤體積。最后一次給藥后，取腫瘤稱重，計(jì)算藥物的抑瘤率及聯(lián)合用藥指數(shù)。取腫瘤組織做免疫組化檢測微血管生成，TUNEL染色檢測腫瘤細(xì)胞凋亡，Western blotting法檢測丹皮酚或/和表柔比星對凋亡蛋白clea

4、ved PARP，cleaved caspase-3，Bax和Bcl-2表達(dá)的影響。最后檢測p38/ERK/JNK MAPKs通路中主要蛋白的表達(dá)，探討丹皮酚或/和表柔比星抑制乳腺腫瘤生長可能介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　3.丹皮酚降低表柔比星誘導(dǎo)的小鼠心臟毒性的研究
　　建立Balb/c小鼠4T1原位乳腺癌模型。待腫瘤長到約100 mm3時，給予丹皮酚(200 mg/kg)灌胃或/和表柔比星(2.5 mg/kg)尾靜脈注射，兩

5、天一次，共八次。每次給藥后，稱量記錄小鼠體重。最后一次給藥后，取血漿及心臟組織稱重，計(jì)算體重以及心臟重量/體重的比值。檢測血漿中LDH、AST、CK和CK-MB的表達(dá)，心肌組織中SOD、MDA、GSH和CAT的活性及含量，HE染色觀察心肌組織病理學(xué)變化，TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡，qRT-PCR檢測炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的變化，Western blotting法檢測丹皮酚或/和表柔比星對凋亡蛋白cleav

6、ed PARP，cleaved caspase-3，Bax和Bcl-2表達(dá)的影響。最后檢測NF-κB通路中主要蛋白的表達(dá)，探討丹皮酚降低表柔比星誘導(dǎo)的心臟毒性可能介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　4.丹皮酚降低表柔比星誘導(dǎo)的小鼠肝臟毒性的研究
　　體外選用原代肝細(xì)胞，MTT法檢測不同濃度的丹皮酚或/和表柔比星對其增殖的抑制作用，評價表柔比星的毒性作用及丹皮酚降低表柔比星的毒性作用。建立Balb/c小鼠4T1原位乳腺癌模型。待腫瘤長到

7、大約100 mm3時，給予丹皮酚(20mg/kg)灌胃3天，每天一次，和/或第四天的表柔比星(9 mg/kg)尾靜脈注射。最后一次給藥后，稱體重，取血漿及肝臟組織稱重，計(jì)算體重以及肝臟重量/體重的比值。檢測血漿中ALT、AST、ALP和GGT的表達(dá)，肝臟組織中SOD、MDA、GSH和CAT的活性及含量，HE染色觀察肝臟組織病理學(xué)變化，TUNEL染色檢測肝臟細(xì)胞凋亡，qRT-PCR檢測炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的變

8、化，Western blotting檢測丹皮酚或/和表柔比星對凋亡蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2及cytochrome c表達(dá)的影響。最后檢測PI3K/Akt/NF-κB通路中主要蛋白的表達(dá)，探討丹皮酚降低表柔比星誘導(dǎo)的肝臟毒性可能介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　結(jié)果：
　　1.丹皮酚增強(qiáng)表柔比星體外抗乳腺癌活性
　　MTT結(jié)果顯示，表柔比星對4T1和MCF-7乳腺癌細(xì)胞

9、具有劑量依賴性抑制作用，IC50值分別為2.05μM和1.98μM，CDI分別為0.59到0.82，0.63到0.84，均小于1，表明丹皮酚能增強(qiáng)表柔比星抗乳腺癌細(xì)胞增殖的活性。丹皮酚(0.2 mM)和/或表柔比星（4μM）孵育4T1細(xì)胞48 h，Hoechst33258染色顯示，表柔比星組、聯(lián)合用藥組出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡特征，包括細(xì)胞核固縮、細(xì)胞膜完整性缺失或呈現(xiàn)核分裂。流式結(jié)果顯示，與對照組相比，表柔比星和聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率明顯增多

10、，分別為37.7％和51.5％。Western blotting結(jié)果顯示，相對于對照組，表柔比星顯著增加凋亡蛋白cleaved PARP，cleaved caspase-3和Bax的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)。在對照組、表柔比星組和聯(lián)合用藥組，p-p38、p-JNK和p-ERK的表達(dá)依次降低，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而總的p38、JNK和ERK表達(dá)并無明顯變化。
　　2.丹皮酚增強(qiáng)表柔比星體內(nèi)抗乳腺癌活性
　　對照組、丹皮酚組、表

11、柔比星組及聯(lián)合用藥組的小鼠腫瘤體積分別823.93mm3、709.1 mm3、284.16mm3和160.34 mm3。丹皮酚組、表柔比星組及聯(lián)合用藥組的抑瘤率分別為9.15％、65.04％和73.63％。兩藥聯(lián)用的理論聯(lián)合效應(yīng)為0.6171，小于實(shí)際聯(lián)合效應(yīng)0.7363，表明丹皮酚與表柔比星具有協(xié)同抗腫瘤作用。免疫組化結(jié)果顯示表柔比星組相對于對照組，VEGF和CD31的表達(dá)減少，而聯(lián)合用藥組兩者表達(dá)更少。TUNEL染色結(jié)果顯示丹皮酚、

12、表柔比星及聯(lián)合用藥的細(xì)胞凋亡率分別為24.67％、59.83％和76.67％。表柔比星顯著增加凋亡蛋白cleaved PARP，cleaved caspase-3和Bax的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)。在對照組、表柔比星組和聯(lián)合用藥組，p-p38、p-JNK和p-ERK的表達(dá)依次降低，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而總的p38、JNK和ERK表達(dá)并無明顯變化。
　　3.丹皮酚降低表柔比星誘導(dǎo)的小鼠心臟毒性
　　與對照組、丹皮酚組相比，表柔

13、比星組的小鼠體重明顯減輕，絕對和相對心臟重量明顯的增加。表柔比星給藥后，血漿中LDH、AST、CK和CK-MB的水平明顯增加，心臟組織中SOD、MDA、GSH和CAT的活性及含量、炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平，與對照組都有顯著的變化。HE染色呈現(xiàn)出嚴(yán)重的心臟損傷，包括胞質(zhì)空泡的形成、心肌纖維腫脹和間質(zhì)出血。TUNEL染色表現(xiàn)出明顯的心肌細(xì)胞的凋亡。在聯(lián)合用藥組，以上變化都有所改善。Westernblottin

14、g結(jié)果顯示，表柔比星組與對照組相比較，顯著增加了心肌組織中凋亡蛋白cleaved PARP，cleaved caspase-3和Bax的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)。增加P-NF-κB的表達(dá)，降低IκBα的表達(dá)。聯(lián)合用藥組則抑制了凋亡蛋白的表達(dá)和NF-κB通路的活性。
　　4.丹皮酚降低表柔比星誘導(dǎo)的小鼠肝臟毒性
　　MTT結(jié)果顯示表柔比星對原代肝細(xì)胞具有的毒性作用，而丹皮酚能降低表柔比星誘導(dǎo)的毒性作用。對照組和丹皮酚組的小鼠

15、體重、肝臟體重、肝臟/體重比值并無差異。表柔比星組的小鼠體重有明顯減輕、絕對和相對肝臟重量則有明顯的增加。而聯(lián)合用藥組與前者相比，呈相反的趨勢。表柔比星給藥后血漿中ALT、AST、ALP和GGT的表達(dá)，肝臟組織中SOD、MDA、GSH和CAT的活性及含量、炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平，與對照組都有顯著的變化。HE染色呈現(xiàn)出嚴(yán)重的肝臟損傷，包括肝細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤和間質(zhì)出血。表柔比星給藥后，TUNEL染色也

16、表現(xiàn)出明顯的肝臟細(xì)胞凋亡。Westem blotting結(jié)果顯示，表柔比星組與對照組相比較，顯著增加了肝臟組織中凋亡蛋白cleavedPARP，cleaved caspase-3、cytochrome c和Bax的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)PI3K/Akt/NF-κB主要蛋白的表達(dá)。相對于表柔比星組，聯(lián)合用藥組的肝損傷有明顯地改善，凋亡蛋白的表達(dá)及PI3K/Akt/NF-κB通路的活性有明顯的抑制。
　　結(jié)論：
　　1

17、.丹皮酚能增強(qiáng)表柔比星體外、體內(nèi)的抗乳腺癌細(xì)胞增殖的活性，其增效作用與抑制乳腺癌細(xì)胞中p38/JNK/ERK MAPK信號通路有關(guān)。
　　2.丹皮酚能降低表柔比星誘導(dǎo)的心臟毒性，其保護(hù)作用與抑制心臟組織中NF-κB信號通路有關(guān)。
　　3.丹皮酚能降低表柔比星誘導(dǎo)的肝臟毒性，其保護(hù)作用與抑制肝臟組織中PI3K/Akt/NF-κB信號通路有關(guān)。
　　4.丹皮酚能降低表柔比星誘導(dǎo)的腎臟毒性，其保護(hù)作用與抑制肝臟組織中NF-κ