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文檔簡介
1、Peptaibols是一類由非核糖體肽合成酶(NOn-Ribosomal Peptide Synthetases,NRPSs)合成的富含α-氨基異丁酸(Aib)、具α-螺旋結(jié)構(gòu),對細(xì)菌、真菌等有拮抗作用的一類特殊的抗菌肽。Peptaibols具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn):含有高比例的非蛋白質(zhì)氨基酸殘基,尤其是富含α-氨基異丁酸(Aib);烷基化的N-末端(通常乙?;?和C-末端羥基化的氨基酸。Aib殘基的存在有利于形成α-螺旋結(jié)構(gòu),所有現(xiàn)在已知的
2、peptaibols都是高度螺旋化的,脯氨酸(Pro)和羥脯氨酸(Hyp)則促使螺旋的彎曲(bends)或結(jié)節(jié)(kinks)的形成。Peptaibols兩親性的結(jié)構(gòu)特性使多個分子在脂雙層膜上能夠形成電荷依賴的離子通道。但是到目前為止只有單體分子的晶體結(jié)構(gòu)被解析,因此只提出了其與脂膜相互作用的模型。目前對于peptaibols的研究也主要集中在對其結(jié)構(gòu)的解析和其與擬態(tài)膜的相互作用方面,而對于其抗菌性質(zhì)、抗腫瘤活性及其作用機(jī)制卻缺乏深入而廣
3、泛的研究?,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的317種peptaibols中有190種來源于木霉菌株。木霉菌是一種廣泛存在于土壤、植物根際和葉面的腐生型真菌,對于多種植物病原真菌具有抑制作用,是一種重要的商業(yè)化生防因子。本課題組在對木霉生防因子Trichodermakoningii SMF2的研究過程中發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生耐熱性的抗菌物質(zhì),且該抗菌物質(zhì)對多種土傳真菌具有拮抗作用。在此研究基礎(chǔ)上,本文分離純化鑒定了該抗菌物質(zhì),并對其抗菌性質(zhì)及抗腫瘤活性進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。
4、 1.康寧霉素的分離、純化和鑒定。采用分子篩層析技術(shù)部分純化了T. koningii SMF2產(chǎn)生的抗菌物質(zhì),采用高效液相色譜技術(shù)對其進(jìn)行了進(jìn)一步分離純化,結(jié)合抗菌活性測定,發(fā)現(xiàn)峰1,2和3的三個組分具有抑菌活性。采用液質(zhì)聯(lián)用(LC-ESI-MS)技術(shù)對三個組分進(jìn)行了鑒定,三種抗菌活性物質(zhì)鑒定為’rrichokonins(TrichokoninⅥ,Ⅶ和Ⅷ),定名為康寧霉素。 2.康寧霉素的抗菌性質(zhì)研究。測定了康寧霉素的抑菌
5、譜,表明康寧霉素對于革蘭氏陽性細(xì)菌及多種植物病原真菌具有抑制作用,但對革蘭氏陰性細(xì)菌沒有作用。測定了康寧霉素對于金黃色葡萄球菌及一株臨床分離的多抗金黃色葡萄球菌的MIC值均為25μM,時間殺菌曲線表明在MIC藥物濃度下康寧霉素對二者的抗菌活性明顯不同。在含MIC濃度康寧霉素的培養(yǎng)基中多次傳代培養(yǎng)后,二者對藥物的敏感性發(fā)生了明顯的變化。 3.康寧霉素的抗腫瘤活性檢測。選取了有代表性的三株腫瘤細(xì)胞系:肺癌細(xì)胞A549、肝癌細(xì)胞Hep
6、G2及胃癌細(xì)胞BGC823作為受試細(xì)胞,初步研究了其抗腫瘤活性。MTT實(shí)驗(yàn)表明,康寧霉素對三者有著強(qiáng)烈的生長抑制作用,IC50值均在25μM左右??祵幟顾鼐哂忻黠@的腫瘤細(xì)胞毒性,很有可能成為有效的抗腫瘤候選藥物。熒光染色觀察的結(jié)果則表明:康寧霉素對三株細(xì)胞的生長抑制有所不同,各自表現(xiàn)出不同的特征。 4.研究了康寧霉素對HepG2細(xì)胞生長抑制的機(jī)理。通過MTT實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)康寧霉素Ⅵ對HepG2細(xì)胞具有劑量依賴性的強(qiáng)烈抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)
7、果表明:康寧霉素Ⅵ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有paraptosis(副凋亡)的一些特征,如細(xì)胞大量死亡、線粒體破壞、以及胞質(zhì)不均質(zhì)化并伴有大量空泡的形成。同時,細(xì)胞死亡伴有DNA降解為較大片段以及線粒體跨膜電勢的破壞。研究表明康寧霉素Ⅵ可形成跨膜Ca<'2+>通道,因而很可能導(dǎo)致HepG2細(xì)胞胞內(nèi)Ca<'2+>濃度的迅速升高。Westernblot檢測發(fā)現(xiàn),康寧霉素Ⅵ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程中抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達(dá)水平下降,而caspase-9前
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