桂德霉素抗腫瘤活性研究.pdf

1、格爾德霉素(GeldanamycinGA)是從鏈霉菌培養(yǎng)液中分離得到的第一個苯醌安莎類抗生素，研究表明GA具有多方面的生物活性。現(xiàn)已證實GA通過特異性的與熱休克蛋白90(Hsp90)結(jié)合，抑制其分子伴侶功能并導致被陪伴分子的去穩(wěn)定和降解。由于GA的作用，參與細胞增殖和生存的許多信號傳遞蛋白(例如跨膜酪氨酸激酶、MET和胰島素樣生長因子-1受體、信號轉(zhuǎn)導蛋白、癌基因和抑癌基因蛋白、嵌合信號蛋白、甾體激素受體(雄激素雌激素孕酮受體)、細胞周

2、期調(diào)節(jié)因子)的穩(wěn)定性或功能都因Hsp90的功能被抑制而受到影響。另外，腫瘤細胞在惡性增殖的過程中經(jīng)常處于應激狀態(tài)，腫瘤細胞Hsp90組成型表達要與正常細胞相比高出2-10倍。因此目前針對Hsp90抑制劑GA的藥物開發(fā)已受到廣泛關注。 肉桂酸(CinnamicAcid，CA)是一種廣泛存在的天然產(chǎn)物，由于在限定范圍內(nèi)無毒性，美國將其列入GRAS(一般公認為是安全的)范圍。故肉桂酸是一類來源廣泛和安全的物質(zhì)。有報道表明它具有廣泛的抗

3、實體瘤活性，包括黑色素癌、前列腺癌、肺癌、膠質(zhì)細胞瘤、肝癌和白血病等。它對腫瘤細胞具有抑制其生長增殖和誘導其分化的作用，而且其衍生物肉桂酰胺類化合物亦具有抗腫瘤括性。 本研究課題通過化學方法將肉桂酸引入到GA的17位得到GA的肉桂酸衍生物，定名為桂德霉素(GuidemycinGUM)，并對GUM的體外、體內(nèi)抗腫瘤活性進行了初步研究。 一、GUM作用于腫瘤細胞的體外實驗研究 1.MTT法檢測GUM對人乳腺癌MCF-

4、7細胞，人胰腺癌SW1990細胞，人肝癌HepG2細胞，人肺癌H460細胞，人大腸癌HCT116細胞，人骨髓瘤U266細胞的增殖抑制作用。 不同濃度的GUM作用細胞48h后，利用MTT法檢測GUM對各種腫瘤細胞的增殖抑制作用。MTT結(jié)果顯示，GUM對腫瘤細胞抑制作用的IC50值分別為MCF-7(13.6±1.6μg/ml)，SW1990(16.8±1.8μg/ml)，HepG2(63.56±5.7μg/ml)，H460(67.4

5、6±7.1μg/ml)，HCT116(283.8±11.8μg/ml)，U266(17.8±2.7μg/ml)。 2.Hoechst33258熒光染色法和AnnexinV-FITC/PI染色結(jié)合流式細胞儀檢測細胞凋亡。 不同濃度GUM作用細胞24h和48h后，細胞凋亡比率逐漸增高，呈濃度依賴性和時間依賴性。其中10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml的GUM給藥24h后誘導細胞凋亡的比率分別為：人乳腺癌MCF-7細

6、胞，5.21％±0.41％、2.7％±0.21％、2.86％±0.25％、2.15％±0.16％(Control)；人胰腺癌SW1990細胞，7.63％±0.56％、5.53％±0.44％、3.85％±0.31％、2.48％±0.28％(Control)；人肝癌HepG2細胞，7.68％±0.59％、6.92％±0.61％、3.72％±0.33％、3.08％±0.32％(Control)；人肺癌H460細胞，9.33％±0.81％、4.

7、92％±0.52％、3.93％±0.37％、3.44％±0.31％(Control)；人骨髓瘤U266細胞，11.22％±0.89％、5.75％±0.47％、4.99％±0.41％、2.63％±0.31％(Control)。三個劑量GUM給藥48h后誘導細胞凋亡的比率分別為：人乳腺癌MCF-7細胞，23.16％±0.97％、7.35％±0.51％、4.96％±0.37％、3.17％±0.24％(Control)；人胰腺癌SW1990細胞

8、，20.47％±0.91％、8.1％±0.73％、4.11％±0.38％、2.71％±0.31％(Control)；人肝癌HepG2細胞，27.55％±1.02％、8.38％±0.69％、3.17％±0.29％、2.8％±0.31％(Control)；人肺癌H460細胞，22.21％±1.27％、12.06％±0.74％、3.9％±0.41％、2.98％±0.29％(Control)；人骨髓瘤U266細胞，25.22％±1.13％、8.

9、0％±0.63％、2.48％±0.29％、2.98％±0.24％(Control)。GUM高劑量組和中劑量組的腫瘤凋亡率顯著高于對照組(P＜0.05，P＜0.001)。熒光顯微鏡下可見10μg/ml和1μg/ml的GUM作用后細胞出現(xiàn)染色質(zhì)凝集、細胞核固縮、核碎裂、形成凋亡小體等典型的凋亡細胞形態(tài)學改變。 3.利用Transwell實驗觀察GUM對人乳腺癌MCF-7細胞、人肝癌HepG2細胞、人肺癌H460細胞、人胰腺癌SW19

10、90細胞遷移能力的影響。 實驗結(jié)果顯示，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml的GUM給藥8h后對腫瘤細胞遷移的抑制率分別為：人乳腺癌MCF-7細胞，79.78％±4.82％、37.42％±2.14％、8.17％±1.12％：人肝癌HepG2細胞，66.62％±3.62％、31.08％±1.96％、7.69％±1.21％；人肺癌H460細胞，33.51％±2.28％、15.13％±1.41％、6.48％±1.38％；人胰

11、腺癌SW1990細胞，72.89％±6.49％、36.25％±3.02％、8.18％±1.07％。GUM對腫瘤細胞的遷移能力有顯著的抑制作用，濃度越大抑制作用越強。高劑量組GUM對腫瘤細胞遷移能力的抑制作用明顯高于肉桂酸給藥組。 4.Westernblot檢測GUM對腫瘤細胞中RAF-1、EGFR、AKT、CDK4和HER-2蛋白水平的影響。 Westernblot檢測結(jié)果顯示GUM明顯減少人乳腺癌MCF-7細胞，人肝癌

12、HepG2細胞，人肺癌H460細胞中RAF-1、EGFR、AKT、CDK4和HER-2的蛋白水平，并且隨著GUM作用濃度的增加，抑制蛋白水平的作用亦隨之加強，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。實驗結(jié)果提示GUM通過與細胞內(nèi)Hsp90的結(jié)合抑制RAF-1、EGFR、AKT、CDK4、HER-2等蛋白因子在細胞內(nèi)正確構(gòu)象的形成，并促使其在細胞內(nèi)被降解，從而抑制腫瘤細胞增殖。 二、GUM的體內(nèi)抗腫瘤實驗研究 1.利用昆明種雄性小鼠對GUM

13、與GA的毒性進行測定。 實驗結(jié)果表明不同劑量的GUM(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)和GA(1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg)連續(xù)腹腔注射給藥10天后，動物存活率有明顯差別。GA給藥組中，高劑量(5mg/kg)給藥實驗動物在第7天全部死亡，中劑量(2.5mg/kg)給藥實驗動物在實驗結(jié)束時存活1只，低劑量(1.25mg/kg)給藥實驗動物在實驗結(jié)束時存活3只。GUM給藥組中，高、中、低劑量給藥

14、組(40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg)實驗動物在實驗結(jié)束時無動物死亡。對照組也無動物死亡。結(jié)果顯示GUM與GA比較，GUM三個劑量組的毒性明顯低于GA三個劑量組。 2.GUM對小鼠移植性肝癌H22模型的抗腫瘤活性。 結(jié)果表明，GUM3個劑量組(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)的實驗動物在連續(xù)腹腔注射給藥10天后，對H22腫瘤的生長具有明顯的抑制作用。GUM高、中、低三個劑量組的抑瘤率分別為6

15、1.8％，38.9％和25.7％，與對照組相比具有顯著性差異。在實驗期間，各組動物的體重變化不大。實驗結(jié)束時，各組動物體重與實驗初期相比略有上升。GUM組的動物體重和對照組相比，沒有顯著性差異。 3.利用人乳腺癌MCF-7移植瘤裸鼠模型，觀察不同劑量GUM對裸鼠移植性腫瘤的生長抑制作用。 GUM腹腔注射給藥，給藥間隔為隔天給藥，給藥次數(shù)共20次。GUM在三個劑量40mg/kg、20mg/kg和10mg/kg作用下，整個實

16、驗過程中沒有出現(xiàn)裸鼠死亡，表明動物能夠耐受注射劑量。高、中、低三個劑量組GUM的抑瘤率分別為65.8％、45.9％、15.4％。40mg/kgGUM在裸鼠體內(nèi)對人乳腺癌MCF-7腫瘤生長具有明顯的抑制作用，與對照組相比具有顯著性差異。在實驗期間，各組動物的體重變化不大。實驗結(jié)束時，各組動物體重與實驗初期相比略有上升，GUM組的動物體重與對照組相比，沒有顯著性差異。 綜上，研究結(jié)果表明GUM能夠抑制體外培養(yǎng)腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤