赤水金釵石斛RAPD反應(yīng)條件優(yōu)化及分析.pdf

1、目的：建立優(yōu)化的金釵石斛隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)擴(kuò)增條件，獲得其DNA指紋圖譜，分析DNA指紋圖譜用于鑒別赤水金釵石斛及其它石斛品種。 方法：(1)分別應(yīng)用植物DNA(小量)抽提試劑盒法、CTAB法及改良CTAB法提取石斛的基因組DNA。(2)設(shè)置模板DNA、Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTPs、隨機(jī)引物的濃度梯度，建立RAPD優(yōu)化體系。(3)在RAPD優(yōu)化條件基礎(chǔ)上，從72個(gè)隨機(jī)引物中篩選出能穩(wěn)定擴(kuò)增的引物，對(duì)12株

2、藥用石斛DNA模板進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，獲得其DNA指紋圖譜，并構(gòu)建UPGMA聚類(lèi)圖。(4)進(jìn)而在相同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)50株赤水金釵石斛進(jìn)行擴(kuò)增，觀察實(shí)驗(yàn)的可靠性、穩(wěn)定性。 結(jié)果：(1)改良CTAB法提取的石斛基因組DNA分子量約23kb，電泳條帶無(wú)拖尾，紫外檢測(cè)OD260/OD280比值是1.72～1.93，較另外兩種方法的OD260/OD280比值高(P＜0.01)。(2)應(yīng)用優(yōu)化后的RAPD反應(yīng)體系，從72個(gè)隨機(jī)引物中篩選出8個(gè)能

3、穩(wěn)定擴(kuò)增的隨機(jī)引物(S11、S33、S48、S51、S65、S70、S71、S90)，用于樣本石斛基因組DNA的PCR擴(kuò)增，共獲得8張石斛DNA指紋圖譜。(3)其中S90擴(kuò)增的DNA指紋圖譜中，3株金釵石斛在500bp處，均擴(kuò)增出一個(gè)相同的條帶，其它品種石斛未擴(kuò)增出此條帶。再擴(kuò)大樣本對(duì)50株赤水金釵石斛用S90進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)在500bp處均有相同條帶。(4)聚類(lèi)分析可知，在遺傳距離為0.4處，可以將12株石斛分為5個(gè)聚類(lèi)群，其中3