赤水金釵石斛黃酮苷的分離鑒定、含量測(cè)定及抗氧化研究.pdf

1、金釵石斛(Demdrobium nobile Lind L.)主產(chǎn)貴州、云南、廣西、四川等地，是歷版《中國(guó)藥典》收載的石斛正品之一，具有養(yǎng)陰清熱、益胃生津的功效。與鐵皮石斛、霍山石斛等石斛同是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目拾遺》、《本草綱目》等典籍中均有記載，其中，金釵石斛滋陰清熱、益胃生津的功效尤其明顯，這與金釵石斛中的成分密切相關(guān)。金釵石斛中的石斛堿是金釵石斛中的主要成分，在歷版中國(guó)藥典中，石斛堿是金釵石斛的含量測(cè)定

2、的指標(biāo)性成分，在國(guó)內(nèi)也有一些關(guān)于石斛多糖的含量測(cè)定的研究報(bào)道，但未見(jiàn)金釵石斛黃酮苷的含量測(cè)定的報(bào)道。本研究是在課題組長(zhǎng)期研究石斛類(lèi)指紋圖譜的基礎(chǔ)上提出的一個(gè)研究思路:金釵石斛的酚類(lèi)全指紋圖譜與鐵皮石斛、霍山石斛等主要幾種藥用石斛的圖譜具有很大的差異性，不同石斛的黃酮苷成分明顯不同，可用于石斛類(lèi)的鑒別，且赤水金釵石斛與其他產(chǎn)地的金釵石斛指紋圖譜有差異，赤水產(chǎn)地的金釵石斛存在峰面積占比較大的特征性圖譜峰，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)此成分進(jìn)行提取分離純化、含

3、量測(cè)定及抗氧化研究，希望為金釵石斛的質(zhì)量控制提供一定的研究基礎(chǔ)。
　　目的:
　　1、本文以貴州省赤水市金釵石斛莖為原料，對(duì)此進(jìn)行提取、分離、純化得到金釵石斛黃酮苷，為開(kāi)展金釵石斛的特征性黃酮苷成分含量測(cè)定研究提供基礎(chǔ)，為金釵石斛的質(zhì)量控制提供研究基礎(chǔ)。
　　2、通過(guò)HPLC建立金釵石斛黃酮苷的含量測(cè)定方法，并測(cè)定十批金釵石斛的含量。
　　3、以赤水金釵石斛黃酮昔為指標(biāo)性成分，測(cè)定不同產(chǎn)地的金釵石斛、不同品種的石

4、斛是否含有此成分，探索赤水金釵石斛黃酮苷的特異性。
　　4、建立MSC氧化損傷模型，通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度黃酮苷對(duì)MSC氧化損傷的修復(fù)作用，研究金釵石斛黃酮苷的抗氧化能力，為開(kāi)展進(jìn)一步的藥理研究提供基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、本次實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用溶劑提取法、有機(jī)溶劑萃取法將金釵石斛中的目標(biāo)成分提取出來(lái)，綜合運(yùn)用大孔樹(shù)脂、羥丙基葡聚糖凝膠（SephadexLH-20）、碳十八反向硅膠幾種色譜分離方法，分離純化得到金釵石斛黃

5、酮苷。經(jīng)過(guò)化合物的理化性質(zhì)及現(xiàn)代波譜學(xué)分析，鑒定出此單體的結(jié)構(gòu)。
　　2、以分離得到的金釵石斛黃酮苷為對(duì)照品，通過(guò)RP-HPLC測(cè)定赤水十批金釵石斛莖中的含量。色譜條件AgiLent SB-Aq柱;流動(dòng)相:乙腈(A)-0.2％（體積分?jǐn)?shù)）磷酸(B)，梯度洗脫:0～10min5％ A→16％A，10～30min16％ A→25％A;檢測(cè)波長(zhǎng):270nm;流速:1.0mL/mL-1。
　　3、采用高效液相法，色譜條件: AgiL

6、ent SB-Aq柱;流動(dòng)相:甲醇(A)-0.2％（體積分?jǐn)?shù)）磷酸(B)，梯度洗脫:0～10min25％ A→30％A，10～15min30％ A→33％A;15～25min33％ A→35％A;25～40min35％A;40～60min35％ A→50％A;檢測(cè)波長(zhǎng):340nm;流速:1.0mL/mL-1。以分離得到的赤水金釵石斛黃酮苷為對(duì)照品，鑒別不同產(chǎn)地的金釵石斛及不同品種石斛的含此成分的研究。
　　4、分離得到原代骨髓間充

7、質(zhì)干細(xì)胞，建立其氧化損傷模型，通過(guò)MTT法檢測(cè)黃酮苷對(duì)H2O2致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。
　　結(jié)果:
　　1、本實(shí)驗(yàn)分離鑒定了金釵石斛酚類(lèi)成分中含量較大的成分——金釵石斛黃酮苷（芹菜素-6-C-α-鼠李糖-8-C-β-葡萄糖苷）。
　　2、金釵石斛黃酮苷對(duì)照品的線性回歸方程y=1640.1x-7881.2(r=1)，在0.58μg～14.5μg范圍內(nèi)呈良好線性，加樣回收率(n=6)范圍為98.38％～103

8、.33％，RSD為1.69％。根據(jù)10批貴州省赤水的樣品測(cè)定的結(jié)果，含金釵石斛黃酮苷范圍是0.103％～0.170％。
　　3、本部分對(duì)赤水、云南、四川、廣西產(chǎn)的金釵石斛與其他品種的石斛進(jìn)行比較研究，在赤水金釵石斛黃酮苷的相應(yīng)的出峰位置上，云南產(chǎn)和四川產(chǎn)的金釵石斛均沒(méi)出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的峰，廣西產(chǎn)石斛在相應(yīng)位置可能含有該成分;鐵皮石斛中可能含有赤水金釵石斛黃酮苷，霍山石斛、紫皮石斛、細(xì)莖石斛、均不含此成分。
　　4、在增殖試驗(yàn)中，各

9、給藥濃度組別和空白組比較，赤水金釵石斛黃酮苷對(duì)MSC沒(méi)有促增殖作用;在對(duì)H2O2致MSC損傷的造模實(shí)驗(yàn)中， H2O2損傷組在600μ M處理2h的條件下抑制率達(dá)到50％左右，因此可選擇此條件為氧化損傷模型;而當(dāng)在赤水金釵石斛黃酮苷對(duì)H2O2致MSC的保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，在10-100μg/mL的濃度范圍內(nèi)，黃酮苷對(duì)H2O2致MSC的損傷均具有修復(fù)作用，且具有量效關(guān)系，說(shuō)明赤水金釵石斛黃酮苷對(duì)H2O2致MSC損傷有一定的保護(hù)作用。
　　結(jié)論

10、:
　　1、本研究中赤水金釵石斛黃酮苷的含量范圍為0.103％～0.170％，相對(duì)于中國(guó)藥典中的石斛堿的規(guī)定含量（不少于0.4％）而言，含量相對(duì)較高。
　　2、本研究建立了金釵石斛的含量測(cè)定方法，該含量測(cè)定方法具有良好的準(zhǔn)確性，重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于金釵石斛的質(zhì)量控制。
　　3、本次不同產(chǎn)地金釵石斛、不同品種石斛與赤水金釵黃酮苷的HPLC比較研究證明了赤水金釵石斛黃酮苷的特異性。
　　4、赤水金釵石斛黃酮苷不同質(zhì)