WNT6基因低表達對MDA-MB-231細胞系生長增殖的影響.pdf

1、目的:研究WNT6基因?qū)θ橄侔㎝DA-MB-231細胞系生長增殖的影響，分析WNT6基因在三陰性乳腺癌發(fā)生中的作用，為探討三陰性乳腺癌發(fā)病的分子機制提供新的實驗依據(jù)。
　　方法:選取三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系為研究對象，針對WNT6基因，設(shè)計三個不同序列的特異性 siRNA( siRNAl、 siRNA2、 siRNA3)，另外設(shè)計不含目的基因的siRNA（scramble siRNA，scRNA）；利用脂質(zhì)體Lipo

2、fectamin2000將siRNA分別轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞系，運用RT-PCR和Western blot檢測WNT6基因的表達情況，選擇沉默效應(yīng)最好的一組 siRNA進行后續(xù)實驗；以未轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細胞系和轉(zhuǎn)染 scRNA的MDA-MB-231細胞系作為對照，運用RT-PCR和Western blot方法，檢測MDA-MB-231細胞系WNT6基因在mRNA及蛋白質(zhì)水平的表達；MTT法繪制細胞生長曲線，分析 WNT

3、6基因表達降低對MDA-MB-231細胞系生長、增殖的影響；軟瓊脂集落形成實驗，觀察各組細胞非停泊依賴性生長情況。
　　結(jié)果：與未轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細胞系比較，siRNAl、 siRNA2、 siRNA3分別轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞系后，RT-PCR檢測WNT6基因mRNA的表達水平明顯降低，分別降低約50％(p<0.01)、40%(p<0.05)和20%(p<0.05)；Westernblot檢測結(jié)果顯示：wnt6蛋

4、白的表達水平也明顯降低，分別比對照組降低約45%(p<0.01)、28%(p<0.05)和10%(p>0.05)，表明siRNAl對WNT6基因的沉默效果最好，因此，后續(xù)實驗選轉(zhuǎn)染 siRNAl的MDA-MB-231細胞系為實驗組；以未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染scRNA的MDA-MB-231細胞系作為對照組，通過RT-PCR、Western Blot檢測分析WNT6基因在各組MDA-MB-231細胞系中的表達情況，結(jié)果表明，與對照組比較，實驗組WNT

5、6 mRNA及蛋白表達水平均分別下調(diào)近50%和40%，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；scRNA組與未轉(zhuǎn)染組比較差異無顯著性(p>0.05)。MTT法繪制生長曲線發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，轉(zhuǎn)染48h后，實驗組細胞生長速度受到明顯抑制，細胞增殖率降低約48%；轉(zhuǎn)染72h后，實驗組細胞增殖率降低約49%，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；scRNA組與未轉(zhuǎn)染組比較細胞增殖率差異無顯著性(p>0.05)。細胞集落形成實驗發(fā)現(xiàn)，實驗組集落形成率