ZIC1基因聯(lián)合苦參堿對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響研究.pdf

1、背景與目的：乳腺癌作為女性面臨的重大威脅，當(dāng)今對(duì)之采取的主流治療手段還是以手術(shù)為基礎(chǔ)的放化療聯(lián)合治療，考慮到其帶來(lái)的各類嚴(yán)重的副反應(yīng)或并發(fā)癥，傳統(tǒng)中藥以及靶向基因結(jié)合治療越來(lái)越為人們所重視和接受。本實(shí)驗(yàn)探討ZIC1基因聯(lián)合苦參堿對(duì)高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖能力、黏附能力、遷移能力及凋亡的影響，進(jìn)而為乳腺癌的治療探索新思路。
　　方法：1.首先將慢病毒載體pLV-Zic1-PGK-puro轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB

2、-231細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，并培養(yǎng)篩選后得到穩(wěn)定傳代的細(xì)胞克隆。
　　2.以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot法）檢測(cè)ZIC1基因轉(zhuǎn)染后在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3.之后以空載體轉(zhuǎn)染的人乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞及 ZIC1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為研究對(duì)象進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)。選取50，100，200，400，800mg/L濃度梯

3、度的苦參堿分別作用于空載體組與轉(zhuǎn)染組48h，四甲基唑藍(lán)法（MTT法）分別測(cè)量苦參堿對(duì)之作用后的生長(zhǎng)抑制率，并篩選出苦參堿處理48h的半抑制濃度（IC50）。
　　4.以上述48h檢測(cè)出的IC50為苦參堿后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度，把細(xì)胞人為地劃分為四組，即A空載不加藥組（陰性對(duì)照組），B空載加藥組，C轉(zhuǎn)染不加藥組和D轉(zhuǎn)染加藥組。對(duì)四組細(xì)胞分別采用如下：（1）細(xì)胞黏附試驗(yàn)及MTT法檢測(cè)細(xì)胞黏附能力，并計(jì)算各組細(xì)胞的黏附率；（2）細(xì)胞劃痕/遷移實(shí)

4、驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，觀察各組細(xì)胞在24h，48h，72h下的遷移程度；（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，分析各組細(xì)胞的凋亡率及凋亡分布情況。
　　結(jié)果：1.攜帶ZIC1基因的慢病毒載體pLV-Zic1-PGK-puro轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，ZIC1在細(xì)胞中的表達(dá)情況：48h熒光顯微鏡檢測(cè)到大量綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染率達(dá)90％。
　　2.蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，ZIC1蛋白在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中均有表達(dá)，而在未轉(zhuǎn)染細(xì)胞均無(wú)表達(dá)。

5、
　　3.藥物的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，經(jīng) MTT檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)苦參堿對(duì)空載及轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞均呈現(xiàn)增殖抑制作用，具有劑量依賴性。其中，濃度為200mg/L的苦參堿作用于空載細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后細(xì)胞增殖抑制率分別為49.21%和52.42%左右，抑制率最接近50%。于是我們選取200mg/L濃度的苦參堿，作為后續(xù)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)濃度。
　　4.在細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中，MTT測(cè)得200mg/L苦參堿處理各組細(xì)胞48h后，轉(zhuǎn)染不加藥組（64

6、.13%）和空載加藥組（49.17%）的細(xì)胞黏附率均低于陰性對(duì)照組，而轉(zhuǎn)染加藥組細(xì)胞的黏附率約為31.23%，均明顯低于其余三組（P<0.05）；在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，隨時(shí)間的延長(zhǎng)每組細(xì)胞遷移的距離逐漸增大，即具有時(shí)效性，并且同一時(shí)間段的MDA-MB-231細(xì)胞遷移的距離，以轉(zhuǎn)染加藥組遷移距離最短，相對(duì)遷移率最低（ P<0.05）；在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，48h的凋亡率以轉(zhuǎn)染加藥組細(xì)胞最高，為34.78%±1.82，其次為空載加藥組（26.3%±

7、1.28）和轉(zhuǎn)染不加藥組（24.24%±1.14），最低為陰性對(duì)照組（7.99%±1.07）。
　　結(jié)論：
　　1.包裹ZIC1基因的慢病毒載體pLV-Zic1-PGK-puro穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中ZIC1的表達(dá)較慢病毒空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　2.苦參堿作用轉(zhuǎn)染細(xì)胞或空載細(xì)胞48小時(shí)的50%抑制濃度（IC50）約為200mg/L。
　　3. ZIC1基因表達(dá)上調(diào)或苦參堿單獨(dú)作用