丁基苯酞對(duì)慢性腦缺血老齡大鼠海馬APP表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的：慢性腦缺血是神經(jīng)系統(tǒng)的一種常見(jiàn)的病理狀態(tài)，伴發(fā)于血管性癡呆(Vascular dementia，VD)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)及Binswanger病等多種疾病的病理過(guò)程中，早期以認(rèn)知功能損害為主要表現(xiàn)，最終導(dǎo)致持久或進(jìn)展性認(rèn)知與神經(jīng)功能障礙，因此研究其發(fā)病機(jī)制對(duì)慢性腦缺血的臨床防治具有普遍意義。慢性腦缺血的病理基礎(chǔ)之一是大腦皮層及其它腦區(qū)出現(xiàn)大量B淀粉樣蛋白質(zhì)(β-amyloidpro

2、tein，A β)沉淀，A β是一種難溶性的蛋白質(zhì)，一般由42(39～43)個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為42kDa，由β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor proteln，APP)水解產(chǎn)生，APP是一個(gè)很大的蛋白質(zhì)分子，分子量為78kDa，APP基因約有170kb，含有18個(gè)外顯子。丁基苯酞是從芹菜籽中提取出來(lái)的左旋體，后經(jīng)人工合成為消旋體，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所的科研人員20余年的研究證明，丁基苯酞對(duì)動(dòng)物急性

3、缺血性卒中具有多種機(jī)制的治療作用，但是該藥用于慢性腦缺血是否有效有待研究。海馬是腦缺血最為敏感的部位，且位置特殊，與認(rèn)知等有密切關(guān)系，海馬CA1區(qū)與海馬內(nèi)部及海馬外結(jié)構(gòu)有廣泛的纖維聯(lián)絡(luò)，是長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)形成及學(xué)習(xí)、記憶的重要部位，因此選擇了大鼠海馬區(qū)作為研究對(duì)象。已有免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丁基苯酞可抑制皮層和海馬的神經(jīng)元變性、壞死，同時(shí)可減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、活化，以及抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞

4、減少，并能改善慢性腦缺血引起的認(rèn)知功能障礙。有關(guān)丁基苯酞治療慢性腦缺血對(duì)A B表達(dá)影響的研究目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。 本文旨在運(yùn)用免疫組織化學(xué)法、RT-PCR法及免疫斑點(diǎn)法觀測(cè)應(yīng)用該藥物干預(yù)后慢性腦缺血老齡大鼠海馬區(qū)APP mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化，進(jìn)一步研究該藥對(duì)慢性腦缺血干預(yù)作用的治療機(jī)制，探討該藥在細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)及蛋白水平的作用機(jī)制，可以讓臨床醫(yī)生更準(zhǔn)確地理解和把握該藥的作用機(jī)制和臨床適應(yīng)癥，為該藥治療慢性腦缺血提供

5、理論依據(jù)。 材料和方法： 1．動(dòng)物分組與模型制備： 試驗(yàn)動(dòng)物選用健康Wistar大鼠150只(鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，雌雄不拘，12-14月齡，體重450-550克。隨機(jī)分為模型組(A)、假手術(shù)組(B)、預(yù)防組(C)、低劑量組(D)和高劑量組(E)，共5組，每組30只。假手術(shù)組僅暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈而不結(jié)扎，余各組采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎(2VO)法制備動(dòng)物模型。C組先給予丁基苯酞80mg．Kg<'-1>．d<'-1

6、>，1月后停藥，行2VO術(shù)；B組正常飼養(yǎng)2月后僅給予安慰劑；A、D、E組行2VO術(shù)，正常飼養(yǎng)2月后，A組給予安慰劑，D組給予丁基苯酞60mg．Kg<'-1>．d<'-1>，E組給予丁基苯酞120mg．Kg<'-1>．d<'-1>．連續(xù)灌胃1個(gè)月：共3月后處死動(dòng)物。 2．標(biāo)本采集： ①免疫組織化學(xué)法標(biāo)本采集：麻醉動(dòng)物，37℃生理鹽水灌洗后斷頭迅速取出腦組織，放入4％多聚甲醛中后4℃冰箱內(nèi)固定24小時(shí)，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯

7、透明，石蠟包埋，制作腦部冠狀石蠟切片(厚度3um)，以備免疫組化染色。 ②RT-PCR及免疫斑點(diǎn)法標(biāo)本采集：麻醉動(dòng)物，斷頭取血后迅速冰上分離腦組織，裝入1.5ml EP管中，-80℃保存，以備RT-PCR及免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)使用。 3．免疫組織化學(xué)法①抗體：一抗兔抗APP單克隆抗體二抗 HRP標(biāo)記山羊抗兔多克隆抗體②免疫組織化學(xué)染色步驟：烘片、脫蠟至水、抗原修復(fù)、血清封閉、加一抗、加二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、分化、封片、照

8、相； ③圖像分析 4．RT-PCR： ①組織總RNA提?。撼蜏乇淙?biāo)本，迅速冰上分離，取出其中一側(cè)海馬，用Trizol法提取組織總RNA，測(cè)定樣品中260nm、280nm吸收峰的0D值，鑒定RNA純度和含量。 ②逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)： * 引物β-Actin：5’GGGAAATCGTGCGTGACAT 3’ 5’ TCAGGAGGAGCAATGATCTTG 3’ APP： 5’

9、 GGGTCTGGGTTGACAAACATC 3’ 5’ CATTCTGCTGCATCTTGGAGA 3’ * 25ul體系，50℃，15min，eDNA合成； 94℃，2min，預(yù)變性； 94℃，30s，變性； 56℃，30s，退火；(經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)確定最適退火溫度為56℃)72℃，1.5min，延伸； 4℃，forever． * 瓊脂糖凝膠電泳配制2％瓊脂糖凝膠，10xBuffe

10、r上樣，EB染色。 ③圖象分析 5．免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)： ①組織總蛋白提取：取另一半海馬用單去污裂解液法提取組織總蛋白。 ②免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)： * 抗體一抗：小鼠抗大鼠IgGl APP單克隆抗體二抗：HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG多克隆抗體* 步驟組織總蛋白液(即抗原液)按1：20稀釋?zhuān)?在醋酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜上點(diǎn)樣，每點(diǎn)10μl，37℃烤干； 脫脂奶粉室溫下封閉1小

11、時(shí)； TBS液洗膜濾紙吸干后加入一抗，室溫下?lián)u床混勻4小時(shí)； TBS液洗膜濾紙吸干后加入二抗，室溫下?lián)u床混勻4小時(shí)； TBS液洗膜濾紙吸干后加入DAB顯色液顯色，室溫下1-3分鐘； ③圖象分析 6．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理e實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析及Q-檢驗(yàn)法處理。以α=0.05作為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果：

12、1．實(shí)驗(yàn)各階段對(duì)大鼠進(jìn)行一般行為學(xué)評(píng)價(jià)顯示：造模成功后大鼠均出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、少食、少飲；術(shù)后1天，假手術(shù)組精神恢復(fù)，余組改善不明顯，部分大鼠出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)，無(wú)明顯肢體癱瘓；3-5天后逐漸恢復(fù)，1周后基本正常，體重恢復(fù)，傷口逐漸愈合；灌服藥物干預(yù)后，預(yù)防組、低劑量組、高劑量組大鼠行為學(xué)均較模型組明顯改善，高劑量組改善最明顯。 2．免疫組織化學(xué)染色見(jiàn)大鼠海馬CA1區(qū)假手術(shù)組細(xì)胞排列正常，細(xì)胞胞膜及胞內(nèi)APP染色較淺，模型組細(xì)胞排列紊亂

13、，錐體細(xì)胞形態(tài)異常，APP染色沉著明顯；預(yù)防組細(xì)胞排列及細(xì)胞形態(tài)較模型組明顯改善，APP染色沉著減少；低劑量組細(xì)胞排列紊亂情況介于模型組和預(yù)防組之間，APP染色沉著減少；高劑量組細(xì)胞排列紊亂情況與預(yù)防組無(wú)明顯差異，APP染色沉著明顯減少。 3．免疫組織化學(xué)各實(shí)驗(yàn)組APP表達(dá)陽(yáng)性區(qū)平均灰度值反映了各實(shí)驗(yàn)組海馬CA1區(qū)細(xì)胞內(nèi)APP免疫組織化學(xué)蛋白水平表達(dá)量，分別為：A組91.612±4.526，B組69.543±1.659，C組84

14、.499±2.005，D組82.098±2.118，E組76.593±2.342；單因素方差分析顯示F=92.899，P=0.000，組內(nèi)差異有顯著性；Q-檢驗(yàn)結(jié)果顯示：A組與其余四組比較P<0.05，B組與C組、D組、E組比較P<0.05，C組與D組比較P>0.05，C組與E組比較P<0.05，D組與E組比較P<0.05。除C組與D組比較差異無(wú)顯著性外，其余各組間比較差異均有顯著性。 4．RT-PCR實(shí)驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)組APP相對(duì)β-

15、actin平均光密度值反映了各實(shí)驗(yàn)組APPmRNA表達(dá)量，分別為：A組105.851±6.372，B組72.350±16.368，C組94.650±2.728，D組93.684±3.982，E組85.182±5.275；單因素方差分析顯示F=20.570，P=0.000，組內(nèi)差異有顯著性。 5．免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)組APP平均光密度值反映了各實(shí)驗(yàn)組APP酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)蛋白水平表達(dá)量，分別為：A組39.757±7.928，B組14.0

16、16±2.888，C組31.149±7.300，D組28.107±6.586，E組20.657±3.541；單因素方差分析顯示F=29.545，P=0.000，組內(nèi)差異有顯著性。 6．三組實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示APP mRNA及蛋白表達(dá)量A組最高，B組最低，丁基苯酞干預(yù)后，C組、D組和E組APP mRNA及蛋白表達(dá)量均較A組明顯降低，且三組間比較E組

17、證實(shí)APP過(guò)量表達(dá)與慢性腦缺血關(guān)系密切。 2．丁基苯酞明顯改善慢性腦缺血大鼠的一般行為學(xué)評(píng)價(jià)及組織學(xué)變化，減輕細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，降低APP在海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞內(nèi)的沉積，抑制海馬APP mRNA及蛋白的表達(dá)，對(duì)慢性腦缺血治療有效，有明顯的腦保護(hù)作用。 3．丁基苯酞降低APP在慢性腦缺血老齡大鼠海馬的表達(dá)，高劑量組海馬細(xì)胞內(nèi)APP沉積、mRNA及蛋白表達(dá)量明顯低于低劑量組及預(yù)防組。 4．對(duì)老齡大鼠預(yù)防性給予預(yù)防劑量丁基