甲狀腺激素上調(diào)Bcl-2的表達(dá)減少慢性腦缺血大鼠海馬細(xì)胞凋亡.pdf

1、研究背景：
　　 當(dāng)今癡呆的發(fā)病率逐年上升，在65歲以上的個(gè)體中癡呆患病率可達(dá)5％-20％，癡呆的高發(fā)病率和高致殘率給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，這已使其成為了21世紀(jì)最嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題之一。但無(wú)論是阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)還是血管性癡呆(vascular dementia，VD)，發(fā)病機(jī)制目前均不明確，故缺乏有效的預(yù)防和治療手段。因此，積極地探索和研究癡呆的病因和發(fā)病機(jī)制已成為防治癡呆的

2、當(dāng)務(wù)之急。
　　 近年的臨床觀察發(fā)現(xiàn)血管性癡呆患者存在血清甲狀腺激素(Thyroidhormones，THs)水平異常，而促甲狀腺激素可維持在正常水平，這種激素水平的變化符合正常甲狀腺功能病態(tài)綜合征(Euthyroid sick syndrome，ESS)的改變。正常甲狀腺功能病態(tài)綜合征是指由嚴(yán)重的甲狀腺外的全身性疾病、手術(shù)和禁食等原因?qū)е碌募谞钕俟δ軝z測(cè)異常，而甲狀腺本身并無(wú)病變的一組臨床綜合征。曾經(jīng)的觀點(diǎn)認(rèn)為這是機(jī)體的一種適

3、應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)，可減輕損傷后的應(yīng)激反應(yīng)程度，但現(xiàn)在越來(lái)越多的人傾向認(rèn)為這是疾病預(yù)后不佳的一種表現(xiàn)。有人提出，正常甲狀腺功能病態(tài)綜合征的發(fā)生可能和下丘腦-垂體-甲狀腺(Hypothalamus-pituitary-thyroid axis，HPT)軸的功能紊亂有關(guān)，各種損傷因素作用于下丘腦，使之發(fā)生功能性或結(jié)構(gòu)性病變，甲狀腺激素的合成及代謝過(guò)程隨即受到影響，而減少的甲狀腺激素?zé)o法負(fù)反饋上調(diào)HPT軸的上游激素，因此產(chǎn)生一系列激素水平的異常及代

4、謝障礙。在一項(xiàng)對(duì)83例70歲以上受試者進(jìn)行的臨床研究中，Ichibangase等人發(fā)現(xiàn)在含癡呆及未癡呆的所有受試者中，年齡與血清游離三碘甲腺原氨酸（3，5，3'-triiodothyronine，T3）濃度均呈負(fù)相關(guān);血管性癡呆患者的血清游離T3水平顯著低于未癡呆者。這些觀察提示，認(rèn)知功能與血清游離T3水平密切相關(guān);在血管性癡呆的患者中，血清游離T3水平可以反映患者的健康及認(rèn)知狀態(tài)。
　　 本課題組在前期研究中，應(yīng)用2VO方法制

5、備慢性腦缺血致血管性認(rèn)知功能障礙（Vascular cognitive impairment，VCI）的動(dòng)物模型，通過(guò)測(cè)定慢性腦缺血后腦組織甲狀腺激素的水平，發(fā)現(xiàn)在大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的同時(shí)，其腦組織甲狀腺素(thyroxine，T4)及三碘甲腺原氨酸的濃度均有所下降，而補(bǔ)充外源性甲狀腺激素的慢性腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，提示血管性認(rèn)知功能障礙可能與中樞甲狀腺激素代謝異常有關(guān)。但甲狀腺激素通過(guò)何種機(jī)制影響大鼠腦缺血后的認(rèn)知功能尚

6、未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，有必要進(jìn)一步明確甲狀腺激素在改善血管性認(rèn)知功能障礙中的作用及機(jī)制，為血管性認(rèn)知功能障礙的防治工作提供必要的理論支持，也為促進(jìn)患者認(rèn)知功能的恢復(fù)創(chuàng)造一種新的可能。
　　 近年來(lái)，人們對(duì)于血管性認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了比較深入的研究。De Jong等人發(fā)現(xiàn)即使在腦血流的恢復(fù)期（雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后6個(gè)月至1年內(nèi)的任何時(shí)間點(diǎn)），大鼠仍存在空間學(xué)習(xí)記憶能力的損害，提示雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后的記憶障礙不僅僅由腦低灌注本身

7、所引起，也與缺血誘發(fā)的永久性損害有關(guān)。Imai等人發(fā)現(xiàn)，在結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后第3-7天即可觀察到人鼠海馬CA1區(qū)部分神經(jīng)元的死亡，術(shù)后第二周，出現(xiàn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元受損的大鼠為6％-29％，而在術(shù)后第四周，該比例增加到55％，這證實(shí)了雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎后的慢性腦缺血會(huì)造成海馬區(qū)的神經(jīng)元損傷。眾多研究表明，慢性腦缺血可通過(guò)炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激引發(fā)海馬區(qū)神經(jīng)元的去極化、胞內(nèi)外離子失衡、細(xì)胞骨架及膜結(jié)構(gòu)改變、線粒體功能障礙及興奮性氨基酸毒性

8、等代謝功能異常，從而造成神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，而缺血后的海馬細(xì)胞凋亡則是血管性認(rèn)知功能障礙的重要致病環(huán)節(jié)。用神經(jīng)保護(hù)劑對(duì)抗缺血腦組織的氧化應(yīng)激或減輕胞內(nèi)鈣超載，可同時(shí)表現(xiàn)出海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的減少及空間學(xué)習(xí)記憶功能的改善，這進(jìn)一步證明了慢性腦缺血會(huì)造成海馬區(qū)的細(xì)胞凋亡，而正是這種細(xì)胞凋亡導(dǎo)致了大鼠認(rèn)知功能的下降。
　　 眾所周知，甲狀腺激素可以影響胚胎腦組織的細(xì)胞增殖、分化過(guò)程，樹(shù)突和軸突生長(zhǎng)，神經(jīng)元遷移，髓鞘形成等，對(duì)哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)

9、系統(tǒng)的發(fā)育成熟至關(guān)重要。然而，甲狀腺激素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用不僅局限于胚胎與年幼個(gè)體，在成年期甚至老年期同樣起著至關(guān)重要的作用，可以說(shuō)，甲狀腺激素對(duì)于個(gè)體的影響是終生性的。它可以調(diào)控乙酰膽堿、多巴胺等多種神經(jīng)遞質(zhì)的作用，可以調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá)和酶蛋白的活性，可以通過(guò)調(diào)控線粒體的功能影響腦組織的能量代謝，也可以通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白激酶等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)節(jié)顱內(nèi)血管的舒張。成年的甲狀腺功能減退癥可能造成患者精神行為等方面的異常，在老年患者則更可能造成

10、皮層萎縮導(dǎo)致癡呆，這些都強(qiáng)調(diào)了甲狀腺激素對(duì)于正常腦功能維持的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，T3可減少缺血再灌注的心肌組織釋放乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)及表達(dá)caspase-3，提示其可減少缺血再灌注組織的損傷及細(xì)胞凋亡。分別于大腦中動(dòng)脈阻斷1小時(shí)及再灌注6小時(shí)時(shí)予大鼠T4腹腔注射，可抑制缺血腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，增加腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子及膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，降低環(huán)氧合酶-2（COX-

11、2）及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Induced nitric oxide synthase，iNOS)等炎癥相關(guān)氧化酶的活性，從而減少急性缺血再灌注后腦梗死灶的面積。在星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入T3，可使膠質(zhì)細(xì)胞本身免受高濃度谷氨酸的毒性反應(yīng)，同時(shí)也可增加與膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的神經(jīng)元的存活率，提示其對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)元同樣具有保護(hù)作用。但甲狀腺激素對(duì)慢性腦缺血海馬的細(xì)胞是否具有保護(hù)作用尚無(wú)有力的文獻(xiàn)支持。若能設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)證明其可減少慢性腦缺血大鼠的海馬細(xì)胞

12、凋亡，將使我們對(duì)甲狀腺激素改善2VO大鼠認(rèn)知功能的機(jī)制有所了解，并更進(jìn)一步確證海馬細(xì)胞凋亡在血管性癡呆發(fā)病機(jī)制中的重要意義。
　　 有研究表明抗凋亡蛋白Bcl-2是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)程序性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。有研究發(fā)現(xiàn)用丙基硫氧嘧啶(PTU)處理造成的大鼠甲狀腺激素減退癥（甲減）模型存在腦內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)和促凋亡蛋白Bax的上調(diào)，同時(shí)腦組織內(nèi)細(xì)胞凋亡增多。甲狀腺激素干預(yù)可增加外傷腦組織的Bcl-2表達(dá)從而減少外傷后的

13、神經(jīng)元凋亡。這些都提示我們甲狀腺激素對(duì)缺血海馬細(xì)胞凋亡的調(diào)控可能通過(guò)對(duì)Bcl-2表達(dá)的調(diào)控實(shí)現(xiàn)。但甲狀腺激素對(duì)Bcl-2的表達(dá)及缺血海馬細(xì)胞凋亡的具體調(diào)控時(shí)間和方式尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 綜上所述，課題組前期研究證明:大鼠慢性腦缺血時(shí)腦組織T3及T4水平明顯低下，并且伴認(rèn)知功能損害，而補(bǔ)充外源性甲狀腺激素可改善缺血損傷的認(rèn)知功能。為了進(jìn)一步闡明甲狀腺激素修復(fù)血管性認(rèn)知功能障礙的作用及其機(jī)制，我們提出假說(shuō):甲狀腺激素通過(guò)減少缺血海馬

14、的細(xì)胞凋亡改善慢性腦缺血后受損的認(rèn)知功能;甲狀腺激素的這種細(xì)胞保護(hù)作用是通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。為證實(shí)該假說(shuō)，本課題擬采用成年大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎術(shù)制備慢性腦缺血致血管性認(rèn)知障礙的動(dòng)物模型，并且設(shè)置缺血后THs干預(yù)處理組，通過(guò)尼氏染色、免疫熒光標(biāo)記及免疫印記檢測(cè)(Westernblotting，WB)等方法，觀察不同組大鼠海馬的細(xì)胞凋亡以及甲狀腺激素是否通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)影響細(xì)胞凋亡，以期從細(xì)胞保護(hù)角度闡明

15、甲狀腺激素改善慢性腦缺血后受損認(rèn)知功能的分子生物學(xué)機(jī)制，為促進(jìn)血管性癡呆患者認(rèn)知功能的恢復(fù)提供新的理論依據(jù)及治療靶點(diǎn)。
　　 研究方法：
　　 一.實(shí)驗(yàn)分組:將50只成年SPF級(jí)雄性大鼠隨機(jī)分為慢性腦缺血組(n=16)，缺血后T3干預(yù)組(n=18)和假手術(shù)組(n=16)。慢性腦缺血組再隨機(jī)分為2VO7天組(n=8)和2VO14天組(n=8);同樣，缺血后T3干預(yù)組隨機(jī)分為T(mén)37天組(n=10)和T314天組(n=8);假

16、手術(shù)組隨機(jī)分為假手術(shù)7天組(n=8)和假手術(shù)14天組(n=8)。每亞組中各取5只大鼠用作切片染色，其余的用作免疫印記(Western Blotting，WB)檢測(cè)。
　　 二.尼氏染色:通過(guò)尼氏染色標(biāo)記神經(jīng)元，觀察術(shù)后14天海馬CA1區(qū)的組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡情況。
　　 三.免疫熒光染色:TUNEL染色分別標(biāo)記術(shù)后7天和14天海馬齒狀回的凋亡細(xì)胞，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)各組海馬齒狀回的細(xì)胞凋亡指數(shù)。
　　 四.免疫印跡檢測(cè):

17、分別觀察術(shù)后7天和14天三組大鼠海馬區(qū)Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。
　　 五.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni法，P＜0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果：
　　 一、術(shù)后14天，假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)整齊，錐體細(xì)胞排列致密，數(shù)量較多。與假手術(shù)組相比，缺血后的CA1區(qū)結(jié)構(gòu)明顯松散雜亂，細(xì)胞層崩解，

18、神經(jīng)元排列稀松且數(shù)量減少。T3組的海馬結(jié)構(gòu)雖與假手術(shù)組相比稍顯紊亂，但較2VO組的結(jié)構(gòu)完整性強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)目則與假手術(shù)組基本一致。
　　 二、術(shù)后7天，三組齒狀回顆粒細(xì)胞的凋亡指數(shù)從高到低依次為2VO組、T3組及假手術(shù)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.060)。假手術(shù)組術(shù)后14天的海馬齒狀回內(nèi)可見(jiàn)少量呈紫色的凋亡細(xì)胞;2VO組術(shù)后14天的海馬齒狀回內(nèi)可見(jiàn)大部分細(xì)胞發(fā)生凋亡;缺血后T3處理組術(shù)后14天的海馬齒狀回約一半的細(xì)胞發(fā)生凋亡。通

19、過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)及計(jì)算可知，三組間的齒狀回細(xì)胞凋亡指數(shù)存在顯著性差異(P＜0.001)，其中2VO組大鼠海馬齒狀回細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于假手術(shù)組(P＜0.001)，缺血后T3干預(yù)組的海馬齒狀回細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于2VO組(P=0.001)。
　　 三、各組上樣蛋白中GAPDH表達(dá)量基本一致。術(shù)后7天時(shí)三組Bcl-2蛋白的表達(dá)量從高到低依次為T(mén)3組、2VO組及假手術(shù)組;術(shù)后14天，2VO組BcL-2蛋白的表達(dá)少于假手術(shù)組，T3組則多于假手