丁基苯酞對(duì)慢性腦缺血老齡大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和GFAP、MBP的影響.pdf

1、缺血性腦血管病是神經(jīng)科學(xué)研究的重要課題之一，多年來國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在急性缺血性腦損傷，而對(duì)慢性腦缺血引起的學(xué)習(xí)記憶障礙缺乏深入系統(tǒng)的研究。慢性腦缺血作為神經(jīng)系統(tǒng)的一種常見病理狀態(tài)，伴發(fā)于腦動(dòng)脈硬化、腦血管性癡呆、阿爾茨海默病(Alzheimer'sDisease，AD)、Binswanger病及動(dòng)靜脈畸形等多種疾病的病理過程中，發(fā)病早期以認(rèn)知功能損害為主要表現(xiàn)，最終可導(dǎo)致持久或進(jìn)展性的認(rèn)知與神經(jīng)功能障礙。隨著時(shí)間推移，我國(guó)進(jìn)入老齡化

2、社會(huì)，預(yù)防、治療主要由慢性腦缺血帶來的認(rèn)知功能障礙就日益顯得重要。 大量研究證實(shí)，慢性腦缺血引起的神經(jīng)元缺失、白質(zhì)損傷可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。皮層和海馬神經(jīng)元是參與學(xué)習(xí)和記憶的重要結(jié)構(gòu)，因此，皮層和海馬神經(jīng)元缺陷可引起學(xué)習(xí)和記憶能力受損。慢性腦缺血后白質(zhì)改變包括少突膠質(zhì)細(xì)胞減少，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增生活化。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的神經(jīng)細(xì)胞，幾乎占腦容量的50％以上，對(duì)神經(jīng)元的存活、腦組織的修復(fù)起著重要作用，同時(shí)，

3、大量的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，又會(huì)影響神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)和突觸的構(gòu)建。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞合成的重要骨架蛋白，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)志。髓鞘是少突膠質(zhì)細(xì)胞包卷軸突而成，髓鞘堿性蛋白(MBP)是中樞神經(jīng)髓鞘的主要成分，由少突膠質(zhì)細(xì)胞分泌和合成，具有神經(jīng)組織特異性，其含量變化可反映腦白質(zhì)少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘的損傷的程度。 丁基苯酞(d1-butylphthalide,NBP)是從芹菜籽中提取出來，后經(jīng)人工合成，為治療腦缺血

4、的一種新藥。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)NBP對(duì)可改善小鼠全腦缺血腦能量代謝，可以增加局部腦缺血大鼠缺血區(qū)的腦血流，能縮小大鼠大腦中動(dòng)脈結(jié)扎后(MCAO)梗塞的面積和改善神經(jīng)功能缺失，能改善MCAO大鼠記憶功能障礙等，但多集中在急性缺血上的研究。本文利用2VO建立慢性腦缺血模型，通過Morris水迷宮評(píng)價(jià)大鼠行為學(xué)變化，光學(xué)顯微鏡、透射電鏡觀察神經(jīng)元的變化和超微結(jié)構(gòu)，免疫組化觀察MBP和GFAP在相應(yīng)腦區(qū)的表達(dá)，旨在探討NBP對(duì)慢性缺血引起的認(rèn)知功能障礙

5、的影響及其作用機(jī)制。 材料方法 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康Wistar大鼠80只，隨機(jī)分為A組：對(duì)照組(假手術(shù)+溶劑)；B組：?jiǎn)渭內(nèi)毖M(手術(shù)+溶劑)；C組：缺血低劑量治療組(手術(shù)+低劑量NBP+溶劑)；D組：缺血高劑量治療組(手術(shù)+高劑量NBP+溶劑)；C組和D組于造模2月后分別按60mg／kg、120mgncg給予丁基苯酞每日灌胃，丁基苯酞用花生油稀釋至2mi。A組和B組每日給與花生油2mi灌胃，各組皆連續(xù)灌胃

6、一個(gè)月。 2．模型的制作 鈍性分離單純?nèi)毖M和缺血高、低劑量治療組大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用0號(hào)手術(shù)線分別結(jié)扎其近心端及遠(yuǎn)心端；分離對(duì)照組雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎。術(shù)后各組大鼠均在常規(guī)條件下飼養(yǎng)。 3．標(biāo)本的制作 手術(shù)3月后，每組取3只大鼠，斷頭后迅速取一側(cè)海馬CAI區(qū)1×1×2mm3大小的腦組織放入磷酸鹽緩沖的4％戊二醛溶液中固定，供做電鏡用，其它大鼠經(jīng)心臟灌注后，用4％的多聚甲醛固定后做石蠟切片，供HE染色或做

7、免疫組化用。 4．觀察指標(biāo) (1)各組于2VO前、2VO后2月、2VO后3月行Morris水迷宮試驗(yàn)進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力的評(píng)價(jià)。 (2)采用HE染色觀察大鼠皮層和海馬的神經(jīng)元細(xì)胞變化 (3)電鏡觀察大鼠皮層和海馬的神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。 (4)免疫組化觀察GFAP和MBP的表達(dá) 5．統(tǒng)Ct方法 所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSSl0．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組間比較采用

8、單因素方差分析，用LSD法進(jìn)行兩兩比較，取Q=0．05作為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況 術(shù)后大鼠均出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食減少。術(shù)后1天，A組精神恢復(fù)；B、C、D組改善不明顯。3-5天B、C、D組逐漸恢復(fù)，1周時(shí)反應(yīng)、進(jìn)食正常。 2．認(rèn)知能力 利用Morris水迷宮測(cè)定學(xué)習(xí)和記憶功能發(fā)現(xiàn)，2VO前A、B、C、D組逃避潛伏期時(shí)間和跨過平臺(tái)次數(shù)比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05

9、)；2VO后2月A組與B、C、D組比較逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng)，跨過平臺(tái)所次數(shù)明顯減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；2VO后3月C、D組與B組比較避潛伏期時(shí)間和跨過平臺(tái)次數(shù)明顯改善，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，D組與C組比較避潛伏期時(shí)間和跨過平臺(tái)次數(shù)也有所改善，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。 3．HE染色 A組：皮質(zhì)和海馬偶有神經(jīng)元細(xì)胞變性、死亡，大部分細(xì)胞形態(tài)正常；B組：神經(jīng)元細(xì)胞大量變性、死亡，

10、神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少。C組：神經(jīng)元變性、死亡B組減輕，正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目較B組多。D組：神經(jīng)元變性、死亡和神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少較C組為輕。 4．電鏡結(jié)果 A組：神經(jīng)元的細(xì)胞核、線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常。B組：神經(jīng)元胞質(zhì)高度水腫樣變，細(xì)胞器數(shù)量明顯減少，線粒體腫脹，線粒體嵴排列紊亂，部分消失。C組：神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)水腫較B組減輕，細(xì)胞器數(shù)量較B組增多，線粒體腫脹較B組減輕。D組：神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)水腫較C組減輕，細(xì)胞器數(shù)量較C組增多，線粒體

11、腫脹較C組減輕。 5．G隊(duì)P免疫組化染色 各組均取海馬、額葉皮層和胼胝體三處進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)GFAP灰度值，海馬：A組：121．264-3．46；B組：85．53±9．18；C組：102．92+5．57；D組：107．424-4．24；額葉皮層：A組：122．11±4．06；B組：87．87'+7．66；C組：107．88'+4．93；D組：113．45±4．77；胼胝體：A組：132．11±0．95；B組：97．16±2

12、．08；C組：118．65±1．30；D組：123．45±1．23。B組與A組相比，GFAP的表達(dá)明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；C組、D組與B組相比GFAP的表達(dá)下降明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，D組與C組相比GFAP的表達(dá)下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。6．MBP免疫組化染色 取內(nèi)囊和胼胝體兩個(gè)部位進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)MBP灰度值，內(nèi)囊：A組：89．274-6．96；B組：126．30___2

13、．80；C組：113．55±2．5；D組：108．25±4．31；胼胝體：A組：94．39±4．89；B組：122．72-+2．40；C組：113．21±2．60；D組：105．00+3．53；B組與A組相比，MBP的表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；C組、D組與B組相比MBP的表達(dá)增高明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，D組與C組相比MBP的表達(dá)較高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。 結(jié)論