丁基苯酞對慢性腦缺血大鼠腦內(nèi)IGF-1和Nogo-A表達的影響.pdf

1、腦血管病是目前世界上最常見的老年疾病之一,發(fā)病率、致殘率及復(fù)發(fā)率均高,與心臟病、惡性腫瘤構(gòu)成人類的三大致死病因,其中缺血性腦血管病占全部腦血管病的大部分,是最常見的腦卒中。慢性腦供血不足最早是在1990年由日本醫(yī)學(xué)家提出來的,是指各種原因?qū)е麓竽X出現(xiàn)慢性的廣泛的供血不足,引發(fā)腦部缺血缺氧而出現(xiàn)一系列腦部功能障礙臨床表現(xiàn)的疾病。目前腦血管病后大腦功能的可塑性研究成為了醫(yī)療界的熱點。影響腦血管病后功能恢復(fù)的因素十分復(fù)雜,大致可分為促進因素和

2、抑制因素兩個方面。
　　腦缺血后能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷或死亡,但同時內(nèi)部的神經(jīng)保護機制也被激活,二者的平衡決定了缺血神經(jīng)細胞的結(jié)局。胰島素樣生長因子(IGF-1)被公認為對腦缺血具有潛在的神經(jīng)保護作用,在大鼠和羊的腦缺血模型上已得到證實。它是一種小分子多肽(7.5Kda),結(jié)構(gòu)上類似胰島素原,屬于生長因子家族,對成熟神經(jīng)元增殖、分化、存活具有重要的作用。而已有研究發(fā)現(xiàn)IGF-1可提高神經(jīng)元的存活率,可促進神經(jīng)突觸形成,具有維持神經(jīng)細胞功

3、能、改善老齡動物的學(xué)習(xí)記憶能力的作用。在利用具有自發(fā)性卒中傾向的高血壓大鼠制作腦缺血再灌注模型中,外源性注射IGF-1可使大鼠海馬神經(jīng)元調(diào)亡細胞減少,對損傷后神經(jīng)元具有神經(jīng)保護作用。
　　成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在能夠限制神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生功能的蛋白,髓鞘相關(guān)蛋白神經(jīng)突起生長抑制分子Nogo是其中最主要的蛋白,分為Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C三種主要異構(gòu)體,其中以Nogo-A與神經(jīng)再生的關(guān)系最為密切,是哺乳動物中樞

4、神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生障礙的重要原因之一。Nogo-A作用的消除可以導(dǎo)致大腦缺血損傷部位結(jié)構(gòu)的重塑和功能的恢復(fù)。同樣Nogo-A基因的失活可以對卒中后的老鼠產(chǎn)生強烈的保護作用。有研究表明慢性腦缺血后認知能力的減退,是由于Nogo-A的強烈表達造成的,它能夠使神經(jīng)元間的纖維聯(lián)系受損,抑制新生顆粒細胞的軸突生長,抑制慢性腦缺血后神經(jīng)功能和認知能力的恢復(fù)。丁基苯酞(dl-butylphthalide,NBP)是我國自主研發(fā)的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的化學(xué)

5、藥物,具有安全性單一體結(jié)構(gòu),是治療急性腦缺血的一種新藥,在慢性腦缺血中研究較少。
　　本文利用2VO建立慢性腦缺血模型,通過Morris水迷宮評價大鼠行為學(xué)變化,用免疫組化方法觀察大鼠在對慢性腦缺血適應(yīng)過程中的Nogo-A和IGF-1表達變化,并探討丁基苯酞對其表達的影響和對大鼠實驗性慢性腦缺血的保護作用。
　　材料方法：
　　1.動物分組及給藥方法健康Wistar大鼠80只,隨機分為A組:對照組(假手術(shù)+溶劑);B組

6、:單純?nèi)毖M手術(shù)+溶劑);C組:缺血低劑量治療組(手術(shù)+低劑量NBP+溶劑);D組:缺血高劑量治療組(手術(shù)+高劑量NBP+溶劑);后兩組于造模2月水迷宮結(jié)束后開始治療,分別按60mg/kg、120mg/kg給予丁基苯酞灌胃,丁基苯酞用花生油稀釋至2ml。前兩組每日給予花生油2ml灌胃,各組皆連續(xù)每日灌胃,持續(xù)一個月。
　　2.模型的制作鈍性分離B、C、D組大鼠雙側(cè)頸總動脈,用O號手術(shù)線分別結(jié)扎其近心端及遠心端;分離對照組雙側(cè)頸總動

7、脈但不結(jié)扎。術(shù)后各組大鼠均在常規(guī)條件下飼養(yǎng)。
　　3.標(biāo)本的制作術(shù)后3月,所有大鼠經(jīng)心臟灌注后,斷頭取腦,用4％的多聚甲醛固定后做石蠟切片,供HE染色和免疫組化用。
　　4.觀察指標(biāo)
　　4.1各組于2VO后3月行Morris水迷宮試驗進行學(xué)習(xí)記憶能力的評價。
　　4.2采用HE染色觀察大鼠海馬和顳葉皮層的神經(jīng)元細胞變化。
　　4.3免疫組化觀察大鼠海馬和顳葉皮層IGF-1和Nogo-A的表達。
　　

8、5.統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)士標(biāo)準差±s表示,應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),用LSD法進行兩兩比較,取a=0.05作為顯著性檢驗標(biāo)準。
　　結(jié)果：1.實驗動物行為觀察術(shù)后各組大鼠均出現(xiàn)進食進水減少,精神差,行為異常。術(shù)后1-2天,除A組精神恢復(fù)外,其余各組行為恢復(fù)不明顯。4-6天B、C、D大鼠逐漸恢復(fù),一周時基本正常。
　　2.認知能力利用Morris

9、水迷宮測定后發(fā)現(xiàn),2VO后3月B組與A組比較逃避潛伏期時間明顯延長,跨過平臺所次數(shù)明顯減少,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05):C、D組與B組比較逃避潛伏期時間明顯減少,跨過平臺次數(shù)明顯增加,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),D組與C組比較避潛伏期時間減少,跨過平臺次數(shù)有所增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.HE染色A組:海馬神經(jīng)元細胞未見變性、壞死,細胞形態(tài)正常。B組:海馬大量神經(jīng)元細胞缺血性變性、壞死,正

10、常神經(jīng)細胞數(shù)較A組明顯減少。C組:海馬神經(jīng)元變性、壞死較B組減輕,正常神經(jīng)細胞數(shù)較B組明顯增多。D組:海馬神經(jīng)元變性、壞死較C組明顯減輕,正常神經(jīng)細胞數(shù)較C組明顯增多。
　　4.IGF-1免疫組化染色各組取顳葉皮層和海馬進行觀察,并統(tǒng)計IGF-1蛋白表達的陽性細胞數(shù),IGF-1陽性細胞在皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)及紋狀體區(qū)具有廣泛性表達,陽性神經(jīng)元胞漿呈棕黃色著色。A組IGF-1蛋白呈少量表達,B組IGF-1的表達與A組相比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意

11、義(P>0.05)。C組和D組IGF-1表達明顯多于B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且D組IGF-1表達明顯多于C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　5.Nogo-A免疫組化染色各組取顳葉皮層和海馬進行觀察,并統(tǒng)計Nogo-A蛋白表達的陽性細胞數(shù),Nogo-A蛋白主要分布于大鼠腦內(nèi)的小突膠質(zhì)細胞及部分神經(jīng)元和纖維胞漿及突起內(nèi),呈棕黃色或棕褐色著色。A組Nogo-A呈少量表達,B組Nogo-A表達均明顯多于A組,差異