基于MB-WCX及MALDI-TOF-TOF MS技術(shù)的胃癌及結(jié)直腸癌血清肽組學(xué)初步研究.pdf

1、胃癌(Gastric Carcinoma，GC)與結(jié)直腸癌(Colorectal Carcinoma，CRC)是威脅人類健康的幾大常見惡性腫瘤之一，在我國有著較高的發(fā)病率與死亡率。防治癌癥措施中關(guān)鍵的一點(diǎn)在于防癌普查，以其盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤，治療癌癥。但是目前臨床缺乏效果明確的無創(chuàng)性檢查手段，要確證腫瘤仍依賴內(nèi)鏡下病理活檢。由于消化道腫瘤往往在癌癥初期缺乏典型癥狀，上述侵入性檢查難以作為常規(guī)篩查手段進(jìn)行普及。因此，臨床急需兼具靈敏度、特異性的

2、非侵入性檢查手段來彌補(bǔ)這一欠缺。血液來源廣泛，獲取容易，血液檢查對于民眾而言耐受度高，是最為理想的標(biāo)本來源。血液腫瘤標(biāo)志物的研究一直是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。但經(jīng)過數(shù)十年的研究，目前仍只有甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)、前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)等寥寥數(shù)種血清腫瘤標(biāo)志物取得較為肯定的效果，而在消化道腫瘤方面，癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，

3、CEA)、糖原19-9(carbohydrate antigen19-9，CA19-9)等均缺乏足夠的靈敏度和特異性?；谫|(zhì)譜技術(shù)的血清肽組學(xué)相關(guān)研究的發(fā)展為尋找新的消化道腫瘤血清標(biāo)志物開辟了新的道路。
　　 1血清肽組學(xué)研究的方法學(xué)優(yōu)化及偏倚研究
　　 血清肽組包含大量的生理與疾病相關(guān)的信息，吸引著研究人員從中尋找疾病相關(guān)多肽標(biāo)記。高質(zhì)量且表達(dá)穩(wěn)定的血清多肽譜是血清肽組學(xué)研究的基礎(chǔ)。血清成分卻極其復(fù)雜，會對其質(zhì)譜分析產(chǎn)

4、生負(fù)面影響。因此選取合適的血清肽分離提純方法很重要。此外，廣泛的觀點(diǎn)認(rèn)為血清肽組的組成和含量會在體外發(fā)生改變，這種改變其與外部環(huán)境密切相關(guān)。這就涉及到與臨床及分析化學(xué)、質(zhì)譜儀，樣本處理和質(zhì)譜分析有關(guān)的偏差，例如：血液采集管，凝血時(shí)間和溫度，凍融次數(shù)以及表面化學(xué)成分、質(zhì)譜樣本結(jié)晶以及激光強(qiáng)度都十分關(guān)鍵。此外，譜對齊被認(rèn)為是信號處理中最大的挑戰(zhàn)。如果恰當(dāng)?shù)膶R，則所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)與那些基因表達(dá)分析所獲得的數(shù)據(jù)就有了可比性，就可以運(yùn)用現(xiàn)有的軟件包

5、進(jìn)行分析。另外，我們想弄清楚，如性別、年齡等人口統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)差異到底對那些用我們的質(zhì)譜平臺繪制的血清多肽譜有些什么影響。在本研究中，我們比較分析了數(shù)種磁珠以及離心超濾管對血清肽分離提純的效力，以及在血清采集、預(yù)處理、質(zhì)譜處理和數(shù)據(jù)處理過程中的許多細(xì)節(jié)的影響，并對性別和年齡差異對血清肽組的影響加以分析，揭示了基于弱陽離子磁珠多肽固相分離技術(shù)(weakcation exchange magnetic beads，MB-WCX)和基質(zhì)輔助激光解

6、吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)的血清肽組學(xué)研究中各種非疾病變量對研究結(jié)果的影響。獲得了研究所需的最佳的變量設(shè)置，為血清肽組學(xué)研究提供依據(jù)。本研究結(jié)果證明血清肽組學(xué)研究的每一個(gè)步驟都需要進(jìn)行嚴(yán)格規(guī)范。
　　 2胃癌及結(jié)直腸癌的特異性血清肽組表達(dá)及診斷模型建立

7、>　　 近年來血清肽組學(xué)方面的研究表明腫瘤狀態(tài)下異常細(xì)胞的生長、侵襲以及免疫系統(tǒng)的改變伴隨著酶和蛋白水解過程的變化，可引起機(jī)體血清肽組特異性的表達(dá)變化。對乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、口腔癌等腫瘤的前期研究顯示，構(gòu)建特異性血清肽組合診斷模型，可以獲得良好的診斷效能。本研究利用前期建立的以MB-WCX和高通量的MALDI-TOF MS技術(shù)為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)化血清肽組學(xué)研究平臺，對40例GC患者，40例CRC患者和40例正常人血清進(jìn)行血清肽組學(xué)分

8、析，利用flexAnalysisTM，和ClinProtTM生物信息學(xué)軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，獲得173個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的血清肽譜峰數(shù)據(jù)。利用Wilcoxon test比較CRC組與正常組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其中81個(gè)峰具有顯著差異(p<0.00001)，約占血清肽譜的46.82％；GC組與正常組數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)有79個(gè)峰具有顯著差異(p<0.00001)，約占血清肽譜的45.7％。通過一種新型的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法CARS,我們優(yōu)化篩選出10個(gè)血清肽峰，并通過偏最

9、小二乘判別分析法(partial leastsquares discriminant analysis，PLS-DA)利用其中5個(gè)峰(X13217.07m/z，X23890.71m/z，X33972.74 m/z，X44963.99m/z和X55864.13m/z)構(gòu)建了CRC判別方程：Z=0.5733X1+0.4129X2+0.5388X3-0.4420X4-0.4899X5。此方程的判別能力評估顯示其十折交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確度達(dá)95.1％，

10、雙盲法對test group進(jìn)行判別的靈敏度達(dá)89.9％，特異度達(dá)98％。用同樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，我們使用另外5個(gè)峰構(gòu)建了GC判別方程：Z=0.4835Y1+0.5390Y2+0.5189Y3-0.4614Y4-0.4317Y5(其中Y12311.37m/z，Y24210.40 m/z，Y35539.74m/z，Y46005.97 m/z，Y56666.69m/z)，用十折交叉檢驗(yàn)評估GC血清肽判別方程預(yù)測能力，提示其準(zhǔn)確性高達(dá)96.6％，

11、特異度為95.9％，靈敏度為95.3％。上述研究結(jié)果表明，GC患者以及CRC患者的血清肽表達(dá)譜與正常人血清肽表達(dá)譜存在顯著差異，其腫瘤特異性的血清肽表達(dá)模式具有潛在的消化道腫瘤血清標(biāo)志物的意義。本研究在嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化及優(yōu)化的血清肽組學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺的基礎(chǔ)上，利用新型的統(tǒng)計(jì)學(xué)手段篩選出一個(gè)優(yōu)化的變量子集，大大提高了模型的預(yù)測能力，所建立的判別方程能夠較為準(zhǔn)確地區(qū)分癌癥患者血清與正常人血清，顯著提高胃癌和結(jié)直腸癌的診斷效能，為尋找新的腫瘤特異性血清標(biāo)