基于UPLC-Q-TOF MS及AFLP技術(shù)輔助遠(yuǎn)志良種選育研究.pdf

1、遠(yuǎn)志作為我國(guó)常用大宗藥材之一，具有安神益智，交通心腎，祛痰，消腫等功效。目前，遠(yuǎn)志栽培品種混亂，新品種的選育主要參考農(nóng)作物的選育標(biāo)準(zhǔn)，以產(chǎn)量，種植年限以及表觀農(nóng)藝性狀為主要選育指標(biāo)。作為一種中藥材，應(yīng)以藥效作為其質(zhì)量的衡量指標(biāo)，而藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)為化學(xué)成分。由于化學(xué)成分的多少不可直接觀察，因此，我們有必要建立遠(yuǎn)志農(nóng)藝性狀與化學(xué)成分含量的相關(guān)性分析，并從DNA分子水平初步探討遺傳差異與農(nóng)藝性狀間的關(guān)系，闡述其遺傳多樣性，進(jìn)而輔助指導(dǎo)育種工作

2、。
　　目的：探究遠(yuǎn)志化學(xué)指標(biāo)成分與農(nóng)藝性狀的關(guān)系，明確提出傳統(tǒng)新品種選育指標(biāo)；找出不同農(nóng)藝性狀對(duì)應(yīng)的差異代謝物，為定向育種提供一種研究思路；篩選出在遠(yuǎn)志中擴(kuò)增多態(tài)性好的引物，并對(duì)多態(tài)性條帶與農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，闡述其遺傳背景。
　　方法：測(cè)定18份遠(yuǎn)志樣品的農(nóng)藝性狀；采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器（High Performance Liquid chromatography-Ultraviolet，HPLC-UV）技術(shù)測(cè)定

3、遠(yuǎn)志中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、口山酮Ⅲ和3,6′-二芥子?；崽堑暮浚焕贸咝б合嗌V-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ Ultra high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC/Q-TOF MS）代謝組學(xué)技術(shù)，分析不同農(nóng)藝性狀的差異代謝物；基于擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ Amplified fragment length pol

4、ymorphism，AFLP）分子標(biāo)記技術(shù)篩選出在遠(yuǎn)志中擴(kuò)增多態(tài)性好的引物，并分析18份遠(yuǎn)志樣品的多態(tài)性條帶。
　　結(jié)果：⑴遠(yuǎn)志的株高、直徑、根長(zhǎng)、根分叉高度、側(cè)根數(shù)及根重六個(gè)農(nóng)藝性狀均存在不同程度的遺傳變異，其中農(nóng)藝性狀株高、根分叉高度、側(cè)根數(shù)、根重的變異程度較大且存在顯著性差異。通過(guò)農(nóng)藝性狀間的相關(guān)性分析可知，直徑與根重的相關(guān)性最大。⑵細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、口山酮Ⅲ和3,6′-二芥子酰基蔗糖含量均達(dá)到2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定的遠(yuǎn)志樣

5、品有1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、13號(hào)、14號(hào)、15號(hào)和17號(hào)。細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量與六個(gè)農(nóng)藝性狀指標(biāo)無(wú)明顯的相關(guān)性；3,6′-二芥子?；崽窃诟^長(zhǎng)的遠(yuǎn)志樣品中的含量較高；而口山酮Ⅲ在根較短、根分叉高度較矮，側(cè)根數(shù)多的樣品中含量較高。⑶從遠(yuǎn)志樣品的 UPLC/Q-TOF MS圖譜中共推斷指認(rèn)29個(gè)化合物。采用UPLC/Q-TOF MS代謝組學(xué)技術(shù)，分別找到了與六個(gè)農(nóng)藝性狀相關(guān)的差異代謝物，其中對(duì)六個(gè)農(nóng)藝性狀分類貢獻(xiàn)較大的差異代謝

6、物主要集中在 Sibiricoses A6、Tenuifoliside B、Tenuifoliside A、PolygalaxanthoneⅢ、Tenuifoliose B、Tenuifoliose A、Polyga lasapo nin xxⅧ這7個(gè)化合物中，說(shuō)明這些化合物與遠(yuǎn)志農(nóng)藝性狀的表達(dá)密切相關(guān)。通過(guò)分析6對(duì)相關(guān)農(nóng)藝性狀的共有差異代謝物發(fā)現(xiàn)，呈正相關(guān)農(nóng)藝性狀的共有差異代謝物在兩農(nóng)藝性狀中的變化趨勢(shì)相同，呈負(fù)相關(guān)農(nóng)藝性狀的共有差異

7、代謝物在兩農(nóng)藝性狀中的變化趨勢(shì)相反。⑷基于AFLP分子標(biāo)記技術(shù)共篩選出在遠(yuǎn)志中擴(kuò)增多態(tài)性好的12對(duì)引物，對(duì)18份遠(yuǎn)志樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，共擴(kuò)增出184個(gè)條帶，多態(tài)性條帶比率為94.57％?；趩我蛩胤讲罘治龇?，篩選了與六個(gè)農(nóng)藝性狀顯著相關(guān)的20個(gè)多態(tài)性條帶。通過(guò)AFLP分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，一個(gè)基因可同時(shí)與多個(gè)性狀相關(guān)，而一個(gè)性狀也可能受多個(gè)基因的共同調(diào)節(jié)。18份遠(yuǎn)志樣品的多態(tài)性條帶聚類結(jié)果與遺傳一致度及遺傳距離的分析結(jié)果相一致。遠(yuǎn)志樣品的農(nóng)藝性狀聚

8、類、液質(zhì)數(shù)據(jù)聚類、多態(tài)性條帶聚類均將樣品分為三大類，但又不完全一致。通過(guò)對(duì)遠(yuǎn)志中化合物與多態(tài)性條帶的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，單個(gè)化合物的合成可能受多個(gè)基因的調(diào)節(jié)，而一個(gè)基因也可能同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)化合物的合成路徑，符合生物系統(tǒng)的復(fù)雜性。
　　結(jié)論：對(duì)于遠(yuǎn)志品種選育來(lái)講，只有結(jié)合化學(xué)成分與農(nóng)藝性狀兩個(gè)指標(biāo)才能更加準(zhǔn)確的指導(dǎo)育種。若遠(yuǎn)志樣品是用作中藥制劑的原料，應(yīng)著重選育4號(hào)、13號(hào)樣品；若遠(yuǎn)志樣品是用作中藥飲片的生產(chǎn)，應(yīng)著重選育1號(hào)、9號(hào)樣品。通過(guò)