基于UPLC Q-TOF MS技術的四物湯藥效物質基礎深入研究.pdf

1、中藥復方在傳統(tǒng)分離分析研究過程中利用的HPLC、HPTLC等技術,分析工作量大,速度慢,對對照品依賴度很高,能夠發(fā)現(xiàn)的四物湯中的化學成分也較少,而現(xiàn)今出現(xiàn)UPLC、LC-MS等技術,分析速度大幅提高,勞動強度明顯減小,在沒有對照品的情況下也能發(fā)現(xiàn)較多的四物湯化學成分。本文采用新技術更加科學深入地認識四物湯的藥效物質基礎以及配伍變化,為指導臨床正確使用該類藥物提供實驗依據(jù)。
　　目的:運用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UPLC

2、-TOF MS)技術平臺和計算機輔助技術,深入認識四物湯水煎液的化學組成及其配伍變化。在研究四物湯復方的基礎上提出了中藥配對比較的研究思路,采用UPLC-QTOF-MS技術對市場上正規(guī)銷售的赤芍和白芍飲片、當歸和川芎飲片進行比較,了解中藥赤芍和白芍煎液、當歸和川芎煎液的化學成分差異。通過對兩組藥對物質基礎研究可以間接考察藥理作用差異,進而為揭示藥效差異的研究提供實驗依據(jù)。
　　方法:本研究主要利用UPLC-Q/TOF-MS技術,并

3、在這個平臺的基礎上,提供相應的幾種改進方法,對四物湯的化學成分進行深入研究。首先通過查閱大量文獻以及使用Formular analyzer插件創(chuàng)建四物湯四種單藥所在屬際(包括地黃屬、當歸屬、白芍屬、藁本屬)植物化合物文獻數(shù)據(jù)庫,建立四物湯的化學指紋圖譜,利用Masslynx4.1軟件獲取data-set中的數(shù)據(jù)保存至Excel表中,通過四物湯以及四組單藥的樣品組與空白組比較,實現(xiàn)信號濾噪。用自制自動化預鑒別Searcher軟件與自建四物

4、湯化學成分數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進行自動化比對,并用自制Sourcer程序分析四物湯信號的單藥來源,實現(xiàn)化學成分快速鑒別。用t檢驗p值排序法尋找四物湯藥味共煎煮過程中含量發(fā)生變化的化學成分。利用UPLC/Q-TOFMS技術建立白芍、赤芍兩味單藥水煎液的化學指紋圖譜并與芍藥屬數(shù)據(jù)庫進行匹配,數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用MassLynx4.1軟件中主成分分析和正交偏最小二乘辨別分析。成分鑒別采用與標準品比較,基于自制自動化預鑒別軟件和芍藥屬質譜數(shù)據(jù)庫的一級質譜精確

5、質荷比分析,二級質譜碎片分析。當歸、川芎兩味單藥水煎液采用同樣的研究方法,利用自制自動化預鑒別軟件,通過一級質譜精確質荷比信息,將統(tǒng)計數(shù)據(jù)與自主研發(fā)當歸、川芎兩藥化學成分數(shù)據(jù)庫進行匹配。得到初步結果后再與標準品比較進行驗證分析。
　　結果:本文建立了四物湯單藥屬際化學文獻數(shù)據(jù)庫,包含文獻化合物分子式、化學名等信息共1000余項,從四物湯水煎液中與四物湯化學文獻數(shù)據(jù)庫匹配后快速鑒別信號達187個,其中根據(jù)信號的質荷比鑒別出19種存在

6、多離子證據(jù)的化學成分。四物湯共煎煮后大多數(shù)成分較單獨煎煮有減少的趨勢,只有極少數(shù)成分在單煎液中沒有信號或信號很弱,而在共煎液中信號明顯,在正、負離子模式下各有3個信號上調(diào)趨勢明顯,推測共煎煮過程中可能只有極少量新生成的化學成分或藥味固有成分煎出大幅增加。氧化芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷分別是赤芍和白芍水煎液中貢獻度最大的兩種差異性化合物。此外,赤芍藥苷、1’-O-benzoylsucrose、牡丹皮苷F、牡丹皮苷C/苯甲酰羥基芍藥苷、牡丹皮苷E、

7、(1S,2S,4R)-trans-2-hydroxy-1,8-cineole-β-D-glucopyranoside、蔗糖、沒食子酰芍藥苷/沒食子酰芍藥內(nèi)酯苷等可能也在赤芍、白芍煎液中含量差異明顯。從當歸、川芎水煎液中快速鑒別信號121個,得到初步結果后再進行標準品比較驗證分析,結果表明三糖類化合物和含有丁烯基苯酞結構的未知化合物可能是當歸和川芎煎液的主要差異化學標記物。
　　結論:本研究探討了在共煎煮過程中四物湯化學成分的變化,