四物湯類方用于婦科血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)與配伍規(guī)律研究——香附四物湯的基礎(chǔ)研究.pdf

1、本論文研究工作為“江蘇省高校自然基金重大基礎(chǔ)研究資助項(xiàng)目-四物湯類方治療婦科血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)與配伍規(guī)律研究”的部分研究內(nèi)容。
　　 論文分六個(gè)章節(jié)討論。
　　 一、文獻(xiàn)研究。
　　 該部分對相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行整理,較系統(tǒng)地綜述了四物湯類方治療婦科血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的傳統(tǒng)與現(xiàn)代認(rèn)識,并對香附四物湯配伍效應(yīng)及其物質(zhì)基礎(chǔ)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。
　　 二、在綜合分析文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,理出研究思路,設(shè)計(jì)可行的實(shí)驗(yàn)方案和技

2、術(shù)路線。
　　 三、通過知識挖掘描述香附四物湯的組方結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)。
　　 基于文獻(xiàn)數(shù)據(jù)挖掘,對香附四物湯組方原則及配伍規(guī)律進(jìn)行探討分析;從中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)庫中檢索出包含香附-延胡索等五個(gè)藥對治療痛經(jīng)的方劑,建立數(shù)據(jù)庫,對其出現(xiàn)頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果,香附四物湯方中的當(dāng)歸、香附和延胡索相似度較高,是本方主要組成單元;在154首治療痛經(jīng)的方劑中,香附-當(dāng)歸藥對使用頻次較高,香附-延胡索藥對最常與四物湯配合運(yùn)用。
　　 四、

3、香附四物湯的的效應(yīng)評價(jià)與物質(zhì)基礎(chǔ)研究。研究內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面:
　　 (一)氣滯血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)效應(yīng)評價(jià)體系的建立與應(yīng)用。
　　 1.以香附四物湯臨床傳統(tǒng)用藥形式-湯劑為研究對象,采用水煎煮的方法進(jìn)行提取,并對其揮發(fā)性成分進(jìn)行收集:在強(qiáng)調(diào)湯劑作為方劑整體作用物質(zhì)的基礎(chǔ)上,又采用現(xiàn)代分離技術(shù)大孔吸附樹脂法對其不同化合物類型進(jìn)行純化富集,制備得15個(gè)樣品供生物效應(yīng)評價(jià)及成分分析,以期探討生物效應(yīng)、效應(yīng)物質(zhì)及其兩者之間的關(guān)系

4、。
　　 2.選擇離體器官模型(離體了宮收縮模型)、整體動(dòng)物模型(原發(fā)性痛經(jīng)模型)對香附四物湯及各分離部位進(jìn)行生物效應(yīng)評價(jià),香附四物湯、醇沉上清液部位和60％乙醇洗脫部位均呈現(xiàn)出對子宮收縮的明顯抑制活性。采用HPLC法對60％乙醇洗脫效應(yīng)部位中主要化學(xué)成分進(jìn)行定量分析,結(jié)果分析測定了效應(yīng)部位中6個(gè)主要化學(xué)成分(即四氫非洲防己堿、普魯托品、紫堇堿、延胡索乙素、四氫黃連堿、小檗堿)的含量。通過離體子宮收縮模型的效應(yīng)驗(yàn)證,表明化合物組

5、能夠較好的代表效應(yīng)部位的效應(yīng),提示香附四物湯治療氣滯血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的效應(yīng)部位中抑制小鼠離體子宮收縮的主要效應(yīng)成分主要為生物堿類化合物,小檗堿對縮宮素誘導(dǎo)的離體子宮收縮抑制效應(yīng)最強(qiáng)。
　　 3.選擇小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)對香附四物湯及各分離部位進(jìn)行免疫相關(guān)的生物效應(yīng)評價(jià),香附四物湯、醇沉上清液部位和30％乙醇洗脫部位具有促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)化作用。采用HPLC法對30％乙醇洗脫效應(yīng)部位中主要化學(xué)成分進(jìn)行定量分析,結(jié)果

6、分析測定了效應(yīng)部位中4個(gè)主要化學(xué)成分(即芍藥內(nèi)酯苷,芍藥苷,阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I)的含量。將化合物組與活性部位進(jìn)行效應(yīng)驗(yàn)證,表明化合物組能夠較好的代表效應(yīng)部位的效應(yīng),提示芍藥內(nèi)酯苷,芍藥苷,阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I是該活性部位的主要活性成分,香附四物湯與四物湯在免疫增強(qiáng)活性中有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 4.選擇急性血瘀大鼠模型從血液流變學(xué)、內(nèi)分泌激素等多方面對香附四物湯及分離部位進(jìn)行生物效應(yīng)評價(jià),主要研究結(jié)果有香附四物湯及其醇溶部位能

7、有效改善急性血瘀SD大鼠全血黏度、血漿黏度、血沉等病理變化,延長TT、APTT,降低纖維蛋白原含量,對卵巢功能也具有一定改善作用,而醇沉部位對血液流變性各項(xiàng)指標(biāo)影響較弱。
　　 5.通過腦微透析色譜聯(lián)用技術(shù)研究香附四物湯對痛經(jīng)模型大鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)的影響,結(jié)果表明香附四物湯在下丘腦阻斷5-HT轉(zhuǎn)變?yōu)?-HIAA。
　　 (二)香附四物湯與基本方用于婦科血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的配伍特點(diǎn)分析。
　　 選擇整體動(dòng)物模型(氣滯血瘀

8、大鼠模型,血虛小鼠模型,熱板致痛小鼠模型,醋酸致痛小鼠模型,原發(fā)性痛經(jīng)小鼠模型)等從血液流變學(xué)、內(nèi)分泌激素、動(dòng)物行為學(xué)等多方面對香附四物湯和基本方進(jìn)行生物效應(yīng)評價(jià)和比較分析。主要研究結(jié)果為:
　　 1.氣滯血瘀SD大鼠模型研究結(jié)果表明,香附四物湯能夠明顯改善氣滯血瘀模型大鼠血液流變學(xué)指標(biāo),而基本方干預(yù)的氣滯血瘀模型大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)改善不明顯。
　　 2.血虛小鼠模型研究結(jié)果表明:香附四物湯干預(yù)的血虛小鼠模型改善外周血象

9、作用不明顯,基本方更有利于調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能,促進(jìn)造血功能的恢復(fù)。
　　 3.熱板致痛小鼠模型,醋酸致痛小鼠模型和原發(fā)性痛經(jīng)小鼠模型研究結(jié)果表明:香附四物湯在這三個(gè)模型上表現(xiàn)的牛物效應(yīng)優(yōu)于基本方,香附四物湯在抑制痛經(jīng)作用中以鎮(zhèn)痛為主。
　　 (三)香附四物湯方藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。
　　 1.香附四物湯組成藥味之一-香附的水溶性成分分離與鑒定,通過色譜分離技術(shù),從香附60％乙醇提取物中分離得到一個(gè)新的腦苷,對其波譜數(shù)據(jù)進(jìn)

10、行分析,該化合物被鑒定為1-O-(β-D-glucopyranosyloxy)-(2S,3R,4E,8Z)-2-[(2'R)-2'-hydroxylignoceranoylamino]-4,8-tetradecene-3-diol,并具有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。
　　 2.采用UHPLC-DAD-ESI-MS法、通過標(biāo)準(zhǔn)化合物對照及質(zhì)譜特征分析對香附四物湯中的主要色譜峰進(jìn)行了歸屬和指認(rèn),分析鑒定了其中包括芳香酸、苯酞類、含

11、氮化合物、萜類、糖等化合物類型的34個(gè)化合物,為闡明香附四物湯的效應(yīng)物質(zhì)提供了依據(jù)。
　　 3.采用HPLC法對香附四物湯醇沉上清部位小分子活性成分進(jìn)行定量分析,結(jié)果分析測定了沒食子酸、綠原酸、芍藥內(nèi)酯苷、咖啡酸、芍藥苷、四氫非洲防己堿、普魯托品、阿魏酸、延胡索乙素、小檗堿等10個(gè)化學(xué)成分的含量,為進(jìn)一步闡明活性部位中各成分與藥效相關(guān)性研究提供參考。
　　 4.通過苯酚/咔唑-硫酸法測定了香附四物湯醇沉沉淀部位的多糖含量

12、,為明晰部位與藥效相關(guān)性研究提供參考。
　　 五、香附四物湯用于模型動(dòng)物與人體的效應(yīng)機(jī)理與代謝特征研究。
　　 (一)香附四物湯對模型動(dòng)物與人體的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)指標(biāo)的影響。
　　 1.通過臨床試驗(yàn),得出結(jié)論:香附四物湯對氣滯血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)患者有治療作用,血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)生與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的各因子變化密切相關(guān),香附四物湯對網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的β-EP、E2、T、外周血象等指標(biāo)具有調(diào)控作用。
　　

13、2.對模型動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究,得出以下結(jié)果:香附四物湯(1)在下丘腦阻斷5-HT轉(zhuǎn)變?yōu)?-HIAA;(2)促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的增殖;(3)直接抑制OT誘導(dǎo)的在體/離體子宮強(qiáng)烈收縮,顯著升高痛經(jīng)小鼠子宮組織中NO水平,且降低子宮組織中鈣離子水平,提高SOD酶活力;(4)改善血瘀大鼠血液流變學(xué)病理變化,抗凝血酶活性;(5)在內(nèi)分泌系統(tǒng),糾正病理狀態(tài)下機(jī)體的E2,P異常水平,抑制COX-2酶活性;(6)在免疫系統(tǒng),促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖,抑制LPS誘導(dǎo)

14、的巨噬細(xì)胞NO釋放。臨床試驗(yàn)與模式動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相互補(bǔ)充,證實(shí)了課題假說:四物湯活血類方具有特定的配伍關(guān)系及內(nèi)在規(guī)律,其治療婦科血瘀證痛經(jīng)是通過共有/各異性效應(yīng)物質(zhì)對神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控和/或直接作用于靶器官而實(shí)現(xiàn)其整體調(diào)節(jié)作用,達(dá)到標(biāo)本兼治的目的。
　　 (二)香附四物湯用于原發(fā)性痛經(jīng)模型動(dòng)物的UHPLC-MS代謝組學(xué)初步研究。
　　 在縮宮素誘導(dǎo)的原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型中,前列腺素和類花牛酸類物質(zhì)含量升高,溶血磷

15、脂降低,香附四物湯對原發(fā)性痛經(jīng)的抑制作用與LPC代謝通路有關(guān)。
　　 (三)香附四物湯在模式動(dòng)物與人體內(nèi)的代謝過程與特征研究。
　　 1.使用UHPLC-Q-TOF-MS聯(lián)用技術(shù),通過MetaboLynxTM軟件處理快速分析了香附四物湯醇沉上清部位在大鼠血漿、尿液、膽汁中的代謝物,從香附四物湯給藥后大鼠的尿液、膽汁和血漿中找到45個(gè)代謝物,包括羥化、甲基化、磺化、葡糖醛酸化、半胱氨酸化、去甲基化、失氧等多種類型;快速分析

16、了香附四物湯60％乙醇洗脫部位中部分牛物堿在大鼠組織中的代謝組分。從大鼠組織中共鑒定分析了包括原型化合物在內(nèi)的16個(gè)成分,從結(jié)果可以看出,該部位中的生物堿原型及其代謝物廣泛分布于各組織器官,甲基化、去甲基化、磺化、單葡糖醛酸化、磺化與葡糖醛酸化結(jié)合是該部位中生物堿的主要代謝類型;
　　 2.使用UHPLC-Q-TOF-MS聯(lián)用技術(shù),通過MetaboLynxTM軟件處理快速分析了香附四物湯在人尿液和血漿中的代謝組分,從服用香附四物