頤神達絡(luò)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、頤神達絡(luò)方是著名中醫(yī)王永炎院士治療腦血管疾病的經(jīng)驗方，由赤芍、葛根、人參三味中藥組成，功效為益氣、活血、健腦。臨床主治血管性癡呆(vasculardementia，VD)。主要藥效研究顯示：頤神達絡(luò)方的有效部位具有較其方劑更強的抗腦缺血作用，能較好地保護缺血性腦損傷，具有健腦益智，抗腦衰之功效。 本論文分六章。 第一章文獻研究 對中藥復(fù)方化學(xué)與創(chuàng)新藥物研究的現(xiàn)狀進行綜述；對近年來有關(guān)參頤神達絡(luò)方中各單味藥的化學(xué)成

2、分和藥理學(xué)研究進展進行綜述，共引文獻144篇。 第二章頤神達絡(luò)方有效部位制備工藝研究 對頤神達絡(luò)方有效部位的制備工藝進行研究。根據(jù)本課題前期工作中提取工藝的研究結(jié)果，采用優(yōu)化的提取工藝提取頤神達絡(luò)方，提取物用大孔吸附樹脂柱制備有效部位。以最大吸附量和吸附—解吸率為考察指標(biāo)，篩選了五種不同型號的樹脂，確定C型樹脂為制備有效部位的樹脂。以葛根素、芍藥苷和人參總皂苷為考察指標(biāo)，篩選了大孔樹脂的各個工藝參數(shù)。確定的工藝條件為：頤

3、神達絡(luò)方用Q％乙醇回流提取L次，Yh/次，B倍溶劑/次，提取液合并減壓回收并干燥。提取物用相當(dāng)于X2倍藥材量的水稀釋，超聲40min，4000轉(zhuǎn)/離心40min，得到55mg/ml的上樣溶液。上樣溶液以V1ml/min的流速上樣，樹脂柱徑高比為J1，上樣量與樹脂體積比為3：1；以S2倍樹脂體積的水清洗樹脂柱后，用N3％乙醇洗脫，洗脫劑用量為2.5倍樹脂體積，洗脫流速為L2ml/min。 對頤神達絡(luò)方有效部位的制備工藝進行了驗證。

4、3批樣品的制備和含量測定結(jié)果表明有效部位的制備工藝合理、穩(wěn)定。有效部位的得率為4～5％，其中葛根素含量19～21％，3'-甲氧基葛根素5～6％，芹糖基葛根素3～4％，大豆苷5～6％，芍藥苷11～14％，人參總皂苷20～22％，總含量在50％以上，符合有效部位的要求。 第三章頤神達絡(luò)方有效部位化學(xué)成分研究 研究頤神達絡(luò)方的化學(xué)成分。采用多種色譜分離方法(AB-8型大孔吸附樹脂、硅膠、ToyopearlHW-40、pharm

5、adexLH-20、聚酰胺、MCIGelCHP-2、YMCC18反相硅膠、制備薄層色譜等)和結(jié)構(gòu)解析技術(shù)(1HNMR、13CNMR、DEPT、HMQC、HMBC、EI-MS、ESI-MS等)，以及化學(xué)方法，對頤神達絡(luò)方中赤芍和葛根兩藥相應(yīng)有效部位的化學(xué)成分進行了研究，用分離得到的化合物和課題組從其它課題中得到的人參皂苷對頤神達絡(luò)方提取物和有效部位HPLC指紋圖譜中的主要色譜峰進行指認。 從赤芍相應(yīng)有效部位中分離鑒定了15個化合物

6、，其中單萜類化合物9個：(1S，2S，4R)-反式-2-羥基-1，8-桉葉素(CS-24)、(1S，2S，4R)-反式-1，8-桉葉素-2-O-β-D-葡萄糖苷(CS-13)、一單萜類化合物的二糖苷(CS-23)、4-乙基芍藥苷(CS-14)、9-乙基芍藥新苷A(CS-21)、芍藥苷(CS-B)、苯甲酰芍藥苷(CS-15)、白芍苷R1(CS-12)、羥基芍藥苷(CS-20)；黃酮類1個：二氫芹菜素(CS-10)；有機(酚)酸類3個：苯甲

7、酸(CS-11)、沒食子酸(CS-19)、沒食子酸乙酯(CS-18)；多酚類1個：鄰苯三酚(CS-27)；甾醇類1個：β-谷甾醇(CS-A)；在這15個化合物中，CS-23經(jīng)文獻檢索確定為新化合物，CS-21為新的天然產(chǎn)物，CS-14、CS-24、CS-13、CS-27、CS-10這5個化合物為首次從赤芍中分離得到。 從葛根相應(yīng)有效部位中分離鑒定了15個化合物，包括10個黃酮類化合物：葛根苷A(GG-13)、4'，8-二甲氧基-

8、7-葡萄糖基異黃酮(GG-2)、葛根素(GG-A)、3'-甲氧基葛根素(GG-B)、3'-羥基葛根素、染料木苷(GG-14)、芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷(GG-1)、大豆素(GG-C)、大豆苷(GG-5)、芹糖基葛根素(GG-6)，脂肪酸類3個：二十四烷酸甘油酯(GG-4)、花生酸(GG-12)、棕櫚酸(GG-10)；三萜類1個：羽扇豆醇(GG-11)；甾醇類1個，β-谷甾醇(GG-D)。在這15個化合物中，GG-13經(jīng)文獻檢索

9、確定為新化合物，暫命名為葛根苷A；GG-2、GG-12和GG-10這3個化合物為首次從葛根中分離得到。 通過對頤神達絡(luò)方提取物HPLC指紋圖譜與處方中單味藥材提取物指紋圖譜的相關(guān)性研究，闡明了頤神達絡(luò)方提取物HPLC指紋圖譜中主要色譜峰的來源。采用添加對照品的方法確定了頤神達絡(luò)方提取物中25個色譜峰的歸屬：沒食子酸(峰1)，羥基芍藥苷(峰2)，3'-羥基葛根素(峰3)，葛根素(峰4)，3'-甲氧基葛根素(峰5)，芹糖基葛根素(峰

10、6)，芍藥苷(峰7)，沒食子酸乙酯(峰8)，大豆苷(峰9)，苯甲酸(峰10)，人參皂苷Rg1(峰11)，芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷(峰12)，葛根苷A(峰13)，4'，8-二甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖基異黃酮(峰14)，大豆素(峰15)，9-乙基芍藥新苷A(峰15)，4-乙基芍藥苷(峰17)，苯甲酰芍藥苷(峰18)，人參皂苷Rb1(峰19)，人參皂苷Rh(r)(峰20)，人參皂苷Rd(峰21)，芒柄花素(峰22)，人參皂苷R

11、h(s)(峰23)，20(s)原人參三醇(峰24)，(1S，2S，4R)-反式-1，8-桉葉素-2-O-β-D-葡萄糖苷(峰25)。 據(jù)據(jù)頤神達絡(luò)方HPLC指紋圖譜中色譜峰的確認結(jié)果，指認了頤神達絡(luò)方有效部位的HPLC指紋圖譜中的18個主要的色譜峰，分別為：羥基芍藥苷(峰2)、3'-羥基葛根素(峰3)、葛根索(峰5)、3'-甲氧基葛根素(峰6)、芹糖基葛根素(峰7)、芍藥苷和沒食子酸乙酯(峰8)、大豆苷(峰9)、苯甲酸(峰14)

12、、芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷(峰16)、葛根苷A(峰17)，4'，8-二甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖基異黃酮(峰18)，大豆素(峰19)、4-乙基芍藥苷(峰20)、苯甲酰芍藥苷(峰21)、人參皂苷Rb1(峰22)、人參皂苷Rhr(峰23)、人參皂苷Rd(峰24)、20(s)原人參三醇(峰25)。 第四章頤神達絡(luò)方及其有效部位質(zhì)量控制方法研究 建立了頤神達絡(luò)方中人參總皂苷的含量測定方法。在用比色法測定人參總皂苷時

13、，發(fā)現(xiàn)赤芍中的芍藥苷類成分對人參總皂苷的測定有干擾，通過反復(fù)試驗，建立了用MCIGelCHP-20柱層析除去芍藥苷類干擾性成分的方法。人參總皂苷樣品用香草醛—高氯酸顯色后比色法測定人參總皂苷的含量，測定波長為553nm，線性范圍為0～0.21525mg，顯色30min后吸收穩(wěn)定性良好。3批提取物樣品和3批有效部位樣品的含量測定結(jié)果表明該法精密度和重復(fù)性良好，回收率合格，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。 首次建立了用高效液相色譜法測定葛根素、3

14、'-甲氧基葛根素、芹糖基葛根素、大豆苷和芍藥苷含量的方法。葛根素、3'-甲氧基葛根素、芹糖基葛根素、芍藥苷和大豆苷分別在0.152μg～0.912μg、0.184μg～1.104μg、0.240μg～1.440μg、0.204μg～1.224μg、0.142μg～0.852μg的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為100.3％、102.1％、99.7％、98.4％、98.5％，RSD分別為4.42％、4.19％、3.94％、3

15、.11％、3.22％。3批提取物樣品和3批有效部位樣品的含量測定結(jié)果表明所建立的方法操作簡便，精密度和重復(fù)性良好，回收率合格，測定結(jié)果準(zhǔn)確。 首次建立了頤神達絡(luò)方有效部位的HPLC指紋圖譜測定方法。在203nm檢測波長下，頤神達絡(luò)方有效部位的HPLC指紋圖譜中色譜峰數(shù)目比230nm、250nm、280nm和300nm下的色譜峰多。隨著檢測波長的增加，色譜峰數(shù)目逐漸減少。提示以203nm為檢測波長，建立頤神達絡(luò)方提取物和有效部位的

16、HPLC指紋圖譜，更具代表性和全面性。在203nm檢測波長下(見圖4-3-1)，頤神達絡(luò)方有效部位的HPLC指紋圖譜中有25個色譜峰(或峰組)，與單味藥材提取物的HPLC指紋圖譜相比較，確定色譜峰1、3～7、9～13、15～19來源于葛根，色譜峰2、8、14、20和21來源于赤芍，色譜峰22～25來源于人參。 第五章頤神達絡(luò)方配伍研究采用拆方分析方法，對頤神達絡(luò)方不同配伍提取物中主要有效成分葛根素、大豆苷、3'-甲氧基葛根素、芹

17、糖基葛根素、芍藥苷和人參總皂苷的含量進行了測定。葛根、赤芍和人參三藥配伍可以使有效成分的提取率增加。雖然葛根中的異黃酮類成分的提取量略有增加，但能顯著增加人參皂苷的提取量，而人參能夠增加芍藥苷的提取量，這可能與人參皂苷的助溶作用有關(guān)。但人參對葛根異黃酮類成分的增溶作用不明顯，具體原因還有待進一步探討。該研究結(jié)果對相關(guān)中藥的制劑的提取工藝設(shè)計也有一定的參考價值。首次應(yīng)用HPLC指紋圖譜技術(shù)對頤神達絡(luò)方配伍規(guī)律進行了研究。在203nm檢測波

18、長下，頤神達絡(luò)方不同配伍HPLC指紋圖譜的多數(shù)色譜峰相應(yīng)峰面積比單味藥材相應(yīng)峰面積增加，其中來自葛根和赤芍的主要色譜峰之間的比值變化不大。提示頤神達絡(luò)方在提取的過程中，由于各成分之間相互作用，僅很少數(shù)成分的略有溶出率下降或無變化，使多數(shù)成分的溶出量有一定程度的增加，總有效成分的提取量增加。葛根和赤芍中主要色譜峰由于多數(shù)變化不大，故主要成分之間的比例變化也不大；由于指紋圖譜中出現(xiàn)源自人參的色譜峰數(shù)目太少，主要成分之間的比例變化規(guī)律還有待進