馬鞭草鎮(zhèn)咳作用及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、馬鞭草為馬鞭草科（Verbenaceae）植物馬鞭草Verbena officinalis L.的干燥地上部分，具有活血散瘀，截瘧，解毒，利水消腫的功效?！禜erbal Drugs and Phytopharmaceuticals》1載，在民間該藥常常被用作利尿藥、祛痰藥和抗風(fēng)濕藥，在西班牙的Navarra地區(qū)，該藥廣泛用于抗炎。桂承會(huì)等于1985年報(bào)道馬鞭草水煎劑有一定鎮(zhèn)咳作用，并證明馬鞭草苷的鎮(zhèn)咳作用與水煎劑基本一致。一般而言，中藥

2、發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)多為一類或幾類物質(zhì)成分，馬鞭草苷為馬鞭草所含成分之一，與其同類的其他成分也有很多，是否發(fā)揮鎮(zhèn)咳作用的為包括馬鞭草苷在內(nèi)的糖苷類物質(zhì)呢?
　　 本文通過(guò)研究馬鞭草提取液及分取液的鎮(zhèn)咳活性，尋找其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上，分離確定馬鞭草有效部位的化學(xué)成分，并對(duì)主要活性物質(zhì)的含量、在動(dòng)物體內(nèi)的吸收、分布等情況進(jìn)行探討，為馬鞭草的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分馬鞭草鎮(zhèn)咳作用的研究
　　 目的：研

3、究馬鞭草鎮(zhèn)咳作用及有效部位，明確馬鞭草鎮(zhèn)咳作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 方法：觀察馬鞭草總提物及分取部位對(duì)小鼠因氨水所致咳嗽以及對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響；利用豚鼠因枸櫞酸所致咳嗽試驗(yàn)對(duì)不同劑量的馬鞭草提取物的鎮(zhèn)咳和咳嗽潛伏期進(jìn)行考察；利用小鼠呼吸道酚紅排痰量試驗(yàn)研究馬鞭草提取物的祛痰作用；探討馬鞭草提取物對(duì)磷酸組胺、氯化乙酰膽堿、氯化鉀所致豚鼠離體氣管痙攣的影響，分析其作用機(jī)制。
　　 結(jié)論：藥效學(xué)研究結(jié)果表明，馬鞭草能

4、夠抑制濃氨水所致小鼠咳嗽、枸櫞酸所致豚鼠的咳嗽反應(yīng)，并有明顯的祛痰、對(duì)抗二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的作用，能夠顯著地對(duì)抗磷酸組胺所致的豚鼠離體氣管平滑肌痙攣。馬鞭草的正丁醇部位和乙酸乙酯部位為發(fā)揮藥效作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 第二部分馬鞭草鎮(zhèn)咳有效部位化學(xué)成分的研究
　　 目的：本研究以馬鞭草正丁醇和乙酸乙酯部分為研究對(duì)象，利用硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠色譜、制備薄層色譜、高效液相制備色譜以及重結(jié)晶等分離純化技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分離研

5、究，尋找含有的化學(xué)成分，并應(yīng)用MS、1H-NMR、13C-NMR現(xiàn)代化手段完成單體化合物分子的結(jié)構(gòu)鑒定，為進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。
　　 方法：干燥的馬鞭草（10kg）適當(dāng)粉碎后，用95％乙醇冷浸二次，浸出液加熱，加入活性炭趁熱抽濾，合并濾液減壓濃縮至粘膏狀（520 g），將其懸浮于飽和NaCl水溶液中，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，繼而得到石油醚部位（11 g）、氯仿部位（39 g）、乙酸乙酯部位（52 g）和正丁

6、醇部位（118 g）。本研究先后對(duì)乙酸乙酯部位和正丁醇部位采用硅膠柱色譜進(jìn)行初步分離，經(jīng)薄層色譜檢識(shí)后，進(jìn)一步用硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠色譜、制備薄層色譜、高效液相制備色譜反復(fù)分離純化得到單體化合物。運(yùn)用MS、1H-NMR、13C-NMR波譜學(xué)方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
　　 結(jié)論：本文對(duì)馬鞭草的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，所選用的提取方法及提取溶劑適當(dāng)，采用了硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠色譜、制備薄層色譜、制備液相色譜等分離手段，共分離得到12個(gè)化合

7、物，并且運(yùn)用多種現(xiàn)代波譜手段及其相關(guān)知識(shí)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，包括6個(gè)黃酮化合物，4個(gè)環(huán)烯醚萜苷類化合物，1個(gè)苯丙素糖苷，1個(gè)甾醇：山奈素，芹菜素，異鼠李素，4'-羥基漢黃芩素，槲皮苷，木犀草素，馬鞭草苷，戟葉馬鞭草苷，桃葉珊瑚苷，龍膽苦苷，毛蕊花糖苷，β-谷甾醇。
　　 第三部分馬鞭草主要糖苷含量測(cè)定的研究
　　 目的：建立HPLC/VWD法同時(shí)測(cè)定馬鞭草中馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷以及利用HPLC/MS/MS法同時(shí)測(cè)定馬鞭草中

8、桃葉珊瑚苷、馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷的含量的方法，以控制該藥材的質(zhì)量。
　　 方法：取馬鞭草藥材粉末約0.5 g，精密稱定，加入80％甲醇20ml，密塞，稱定重量，超聲處理45 min，放冷，稱重，用80％甲醇補(bǔ)充減失的重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，進(jìn)樣測(cè)定。HPLC/VWD法采用Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），乙腈.水（15：85）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)

9、為238 nm。HPLC/MS/MS法采用色譜柱Waters SunfireTM C18（150 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈-0.1％甲酸溶液（25：75→40：60）（0→6 min）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速0.8 ml/min，進(jìn)樣量5μl。
　　 結(jié)論：本部分利用HPLC/VWD法建立了同時(shí)測(cè)定馬鞭草中馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷含量的方法，并利用HPLC/MS/MS建立了馬鞭草中馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷、桃葉珊瑚苷、

10、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷同時(shí)測(cè)定的方法，二者均有較高的專屬性、靈敏度，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，能夠滿足馬鞭草藥材質(zhì)量控制的要求。
　　 第四部分馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷藥代動(dòng)力學(xué)與組織分布的研究
　　 目的：建立高效液相色譜法測(cè)定大鼠血漿中馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷濃度的方法，并研究馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷單體以及馬鞭草提取物單次給藥后在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程：研究馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷在大鼠體內(nèi)的組織分布。
　　 方法

11、：大鼠以灌胃給予馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷單體以及馬鞭草提取物，分別于給藥后30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360 min內(nèi)眥動(dòng)脈取血，置于肝素化塑料離心管中，樣品預(yù)處理采用甲醇沉淀蛋白后氮?dú)獯蹈?，水?fù)溶，利用HPLC內(nèi)標(biāo)法（芍藥苷），色譜柱為反相C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-水（15：85），流速為1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)238nm；取大鼠隨機(jī)分為6組，

12、灌胃給予馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷單體以及馬鞭草提取物后，于60、180、300 min分別放血處死，取心、肝、肺、脾、腎、腦、胃和腸，經(jīng)生理鹽水沖洗，去除少量的淤血或組織內(nèi)容物，并用濾紙吸去水分，稱重后于勻漿器中制成500mg·mL-1的生理鹽水勻漿，采用甲醇沉淀蛋白后氮?dú)獯蹈伤畯?fù)溶的方法，利用HPLC法（同上方法）測(cè)定組織中的馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷含量。
　　 結(jié)論：灌胃后馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷單體生物利用度明顯高于馬鞭草提取物

13、中的馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷；馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷主要分布在胃、肝、心、小腸及脾。在腦中的分布表示馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷能透過(guò)血腦屏障。在所研究的組織中，未見明顯的特殊蓄積現(xiàn)象。
　　 第五部分馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定
　　 目的：建立馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷在大鼠血漿、人血漿和牛血清白蛋白中蛋白結(jié)合率的測(cè)定方法，并計(jì)算不同種屬血漿蛋白的相關(guān)參數(shù)。
　　 方法：采用平衡透析法測(cè)定血漿蛋白結(jié)合率，用

14、高效液相色譜法測(cè)定血漿中藥物總濃度及游離的藥物濃度。
　　 結(jié)論：本文應(yīng)用平衡透析法研究了馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷與人血漿蛋白、牛血清白蛋白和大鼠血漿蛋白的結(jié)合情況，結(jié)果表明馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷的血漿蛋白結(jié)合率較低，屬低血漿蛋白結(jié)合率藥物，大部分藥物分子以游離形式發(fā)揮藥效，并且不具有濃度依賴性，不易引起具有藥理作用的游離型血藥濃度發(fā)生明顯變化，說(shuō)明馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷臨床用藥有較好的安全性。
　　 第六部分馬鞭草苷和戟

15、葉馬鞭草苷大鼠在體腸吸收動(dòng)力學(xué)的研究
　　 目的：建立同時(shí)測(cè)定腸循環(huán)液中馬鞭草苷或戟葉馬鞭草苷與酚紅濃度的HPLC/DAD法，探討馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷在大鼠各腸段的吸收動(dòng)力學(xué)特征及不同藥物濃度對(duì)其的影響。
　　 方法：采用大鼠在體腸吸收實(shí)驗(yàn)方法，以HPLC/DAD法測(cè)定腸循環(huán)液中藥物的含量，色譜條件為：Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫30℃；流動(dòng)相為乙腈：0.05％磷酸溶液，

16、梯度洗脫，流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm（馬鞭草苷或戟葉馬鞭草苷）和430 nm（酚紅）：進(jìn)樣量20μL。
　　 結(jié)論：本文首次建立了HPLC/DAD法同時(shí)測(cè)定腸循環(huán)液中馬鞭草苷或戟葉馬鞭草苷及酚紅的濃度的方法，該法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高。研究結(jié)果表明，馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷在腸道的吸收呈現(xiàn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程，且吸收機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散；馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷在整個(gè)腸道均有吸收，可以將馬鞭草苷或戟葉馬鞭草苷研制成緩釋制