基于UPLC-Q-TOF MS代謝組學(xué)和DGE轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究遠(yuǎn)志中三萜皂苷的生物合成規(guī)律.pdf

1、選題依據(jù)：遠(yuǎn)志皂苷是三萜類皂苷的一種，為遠(yuǎn)志藥材次生代謝產(chǎn)物中最重要的組成成分，其已被證實(shí)的藥理活性有鎮(zhèn)靜祛痰、益智安神及抗衰老等。提高遠(yuǎn)志藥材中遠(yuǎn)志皂苷的含量，對(duì)探究遠(yuǎn)志藥材的質(zhì)量具有重要意義，為總皂苷定向育種、研制總皂苷新藥提供原料。而遠(yuǎn)志藥材中遠(yuǎn)志皂苷含量的提高，主要依賴于對(duì)遠(yuǎn)志皂苷生物合成途徑起關(guān)鍵作用的基因以及其對(duì)調(diào)控的全面了解。
　　目前，通過(guò)基因調(diào)控手段完成遠(yuǎn)志次生代謝產(chǎn)物調(diào)控的方案尚存在以下問(wèn)題：（1）國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)

2、于遠(yuǎn)志藥材的研究大多集中于對(duì)其藥理活性、化學(xué)成分和栽培技術(shù)等方面的研究，而分子水平方面的研究則比較少，遠(yuǎn)志相關(guān)酶基因數(shù)據(jù)庫(kù)更是缺乏。（2）遠(yuǎn)志皂苷為三萜皂苷類化合物，其下游代謝通路每個(gè)物種都有其各自的規(guī)律，研究的較少。（3）本課題組前期已采用第二代高通量Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)遠(yuǎn)志根組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究，但該技術(shù)只能測(cè)得遠(yuǎn)志藥材中的全部基因，并不能提供其準(zhǔn)確含量。
　　目的：
　　1.基于數(shù)字表達(dá)譜（DGE）高通量測(cè)序技

3、術(shù)進(jìn)行遠(yuǎn)志表達(dá)譜研究，豐富遠(yuǎn)志的基因資源。
　　2.通過(guò)熒光定量PCR（ qRT-PCR）技術(shù)和串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀聯(lián)用（UPLC/Q-TOF MS）植物代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合，分析遠(yuǎn)志三萜皂苷的峰強(qiáng)度與遠(yuǎn)志三萜皂苷的合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)高低的相關(guān)性，找到影響不同發(fā)育階段遠(yuǎn)志皂苷合成途徑中差異表達(dá)的功能基因，為今后在分子生物水平上調(diào)控遠(yuǎn)志皂苷的含量奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.應(yīng)用DGE高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)遠(yuǎn)志根組織進(jìn)

4、行表達(dá)譜測(cè)序，并在分子生物學(xué)水平上進(jìn)行分析，以獲得大量遠(yuǎn)志基因信息。
　　2.采用UPLC/Q-TOF MS代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)不同發(fā)育階段遠(yuǎn)志進(jìn)行代謝組學(xué)研究，分析并指認(rèn)次級(jí)代謝物在不同發(fā)育階段的含量差異。
　　3.基于先前DGE表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，采用qRT-PCR技術(shù)，運(yùn)用2-ΔΔCT法對(duì)涉及遠(yuǎn)志三萜皂苷生物合成途徑的21條基因在遠(yuǎn)志不同發(fā)育階段表達(dá)水平進(jìn)行分析。通過(guò)皂苷合成途徑中酶基因表達(dá)與UPLC/Q-TOF MS皂苷峰強(qiáng)度

5、的結(jié)合分析，描述造成不同發(fā)育階段間遠(yuǎn)志次生代謝產(chǎn)物差異的分子機(jī)理。
　　結(jié)果:
　　1.得到39,625條Unigenes，總長(zhǎng)54,594,810 bp；通過(guò)分別與Nr、GO數(shù)據(jù)庫(kù)、KO數(shù)據(jù)庫(kù)、NOG數(shù)據(jù)庫(kù)及 Swissprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)Unigenes進(jìn)行了功能比對(duì)和注釋。
　　2.成功構(gòu)建了6Y、9Y和11Y，3個(gè)不同發(fā)育階段遠(yuǎn)志藥材的 DGE文庫(kù)。12,187條參與代謝途徑的Unigenes，共找到

6、419條代謝途徑。6Y與9Y，9Y與11Y，6Y與11Y相比，分別有1,143、520和1,625條差異表達(dá)基因。
　　3.通過(guò)UPLC/Q-TOF MS對(duì)化合物進(jìn)行鑒定與指認(rèn)，共鑒定出24個(gè)化合物，其中包括6個(gè)蔗糖酯類物質(zhì)、2個(gè)口山酮類物質(zhì)、10個(gè)低聚糖酯類物質(zhì)及6個(gè)三萜皂苷類物質(zhì)。最終確定皂苷 Polygalasaponin XXVIII、蔗糖酯 Sibiricoses A5、Tenuifoliside A與低聚糖 Tenui

7、foliose K、Tenuifoliose E是影響不同發(fā)育階段遠(yuǎn)志藥材的有效物質(zhì)。
　　4.采用2-ΔΔCT法對(duì)遠(yuǎn)志皂苷生物合成途徑涉及的21種關(guān)鍵基因在遠(yuǎn)志不同發(fā)育階段的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，通過(guò)遠(yuǎn)志三萜皂苷峰強(qiáng)度與遠(yuǎn)志皂苷合成途徑中酶基因表達(dá)的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)基因CYP716B1、CYP98A3、CYP86B1、CYP94A1和UGT83A1與皂苷合成密切相關(guān)。
　　結(jié)論：本研究采用DGE高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同發(fā)育階段遠(yuǎn)