胎盤(pán)來(lái)源的gp96-抗原復(fù)合物作為多價(jià)的腫瘤預(yù)防性疫苗.pdf

1、盡管近些年對(duì)腫瘤的發(fā)病機(jī)理取得了深刻的認(rèn)識(shí)，在腫瘤的治療方面取得了極大的進(jìn)步，但是腫瘤依然存在，腫瘤發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐漸的增加。與感染性疾病有效的預(yù)防性疫苗不同，腫瘤治療性疫苗治療效果有限。使用腫瘤治療性疫苗治療腫瘤好比是使用乙型肝炎病毒或者人乳頭瘤狀病毒疫苗去治療慢性乙型肝炎病毒感染或者人乳頭瘤狀病毒感染一樣非常具有難度。之前的研究報(bào)道了幾種可能的機(jī)制來(lái)解釋腫瘤逃逸和免疫抑制。腫瘤逃逸和免疫抑制可能是腫瘤長(zhǎng)期的發(fā)生和發(fā)展引起的，包括

2、T細(xì)胞反應(yīng)的損傷，免疫耐受和抑制性的腫瘤微環(huán)境，這些因素可能是協(xié)同起作用的。因此迫切需要開(kāi)發(fā)出腫瘤預(yù)防性疫苗，腫瘤預(yù)防性疫苗是低價(jià)的和高效的腫瘤防治的方案。設(shè)計(jì)腫瘤預(yù)防性疫苗的一個(gè)難點(diǎn)是分離鑒定安全且具有免疫原性的并且具有有效靶向的腫瘤抗原，包括腫瘤特異性的抗原和正常組織中不表達(dá)而腫瘤組織中高表達(dá)的蛋白。至今，只成功的鑒定出有限數(shù)量的腫瘤抗原。但是腫瘤具有很大的異質(zhì)性，單價(jià)腫瘤抗原的疫苗可能很難發(fā)揮有效的作用。目前，腫瘤預(yù)防性疫苗缺乏有

3、效的設(shè)計(jì)和相應(yīng)的實(shí)現(xiàn)手段。
　　 很多的研究已經(jīng)報(bào)道腫瘤細(xì)胞能夠表達(dá)各種似胚胎的抗原，腫瘤組織和胚胎組織表達(dá)的抗原具有高度的相似性，這種特性為靶向胚胎抗原作為預(yù)防腫瘤發(fā)生提供了有效的方法。胎盤(pán)組織同樣高表達(dá)腫瘤相關(guān)的抗原，包括IGF2，HIF-2α，GPC3，PAPP-A，和MUC1等。而gp96作為熱休克蛋白HSP90家族的一員，具有結(jié)合抗原多肽的獨(dú)特的能力，gp96與抗原呈遞細(xì)胞細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合將結(jié)合的抗原多肽交叉呈遞給

4、MHCⅠ和MHCⅡ類(lèi)分子，激活特異性的T細(xì)胞反應(yīng)。我們實(shí)驗(yàn)室之前的研究證實(shí)了在乙型肝炎病毒引起的肝癌中，gp96能夠結(jié)合乙型肝炎病毒來(lái)源的多肽。臨床上使用自體gp96-多肽復(fù)合物治療性疫苗已經(jīng)開(kāi)始治療多種腫瘤，但是自體gp96-多肽復(fù)合物疫苗來(lái)源有限嚴(yán)重影響了疫苗的療效?；谝陨蟽煞矫娴难芯浚菊撐牡哪康氖翘剿魈ケP(pán)來(lái)源的gp96能否激活預(yù)防性的抗腫瘤的T細(xì)胞反應(yīng)，以及其發(fā)揮作用的具體作用機(jī)制。
　　 1、P-gp96激活抗B16

5、-F10黑色素瘤和TUBO乳腺癌特異性的T細(xì)胞反應(yīng)
　　 胎盤(pán)組織來(lái)源的gp96(P-gp96)，肝臟組織來(lái)源的gp96(L-gp96)和PBS皮下免疫C57BL/6小鼠或者BALB/c小鼠三次，最后一次免疫后一周小鼠皮下接種B16-F10黑色素腫瘤細(xì)胞或者TUBO乳腺癌腫瘤細(xì)胞。與L-gp96或者PBS免疫相比，P-gp96免疫能夠顯著地抑制腫瘤的生長(zhǎng)，降低腫瘤體積和延長(zhǎng)小鼠的存活率。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明P-gp96免疫顯

6、著地增加腫瘤特異性的T細(xì)胞。此外殺傷實(shí)驗(yàn)表明，與L-gp96免疫相比，P-gp96免疫有效地激活了高細(xì)胞毒性的CTLs。
　　 2、P-gp96免疫抑制DMBA誘發(fā)的大鼠乳腺癌的發(fā)生和HER2轉(zhuǎn)基因鼠自發(fā)乳腺癌的發(fā)生和生長(zhǎng)
　　 使用大鼠胎盤(pán)來(lái)源的gp96免疫大鼠完全的抑制7，12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)誘發(fā)的乳腺癌腫瘤的發(fā)生。FVB/N-Tg(MMTVneu)202Mul/J小鼠胎盤(pán)來(lái)源的gp96免疫FVB/N

7、-Tg(MMTVneu)202Mul/J轉(zhuǎn)基因鼠顯著的抑制自發(fā)乳腺癌腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)。
　　 3、P-gp96可能結(jié)合Muc1和Her2來(lái)源的多肽
　　 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示小鼠，大鼠和人的胎盤(pán)組織中腫瘤相關(guān)的基因（MUC1， HER2/ERBB2， MMP2， FGF2， c-Myc和VEGF-a）的表達(dá)水平顯著地高于肝臟組織?；|(zhì)輔助激光解析離子化串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜的結(jié)果顯示P-gp96結(jié)合了大量分子量從700到

8、1，500 Da的多肽。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P-gp96免疫BALB/c小鼠顯著的增加Kd限制性Her2顯性表位E63特異性的T細(xì)胞。P-gp96，三氟乙酸處理后的P-gp96(TFA-gp96)和PBS體外刺激人的PBMCs細(xì)胞，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明P-gp96處理能夠顯著的激活Muc1和Her2表位肽特異性的CTLs。此外，P-gp96處理PBMCs能夠顯著的增加PBMCs對(duì)MUC1陽(yáng)性的MCF-7乳腺癌細(xì)胞系的殺傷能力。本

9、實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了胎盤(pán)來(lái)源的gp96的新的免疫原性，以及其作為多價(jià)的腫瘤預(yù)防性的疫苗的潛在應(yīng)用價(jià)值，為開(kāi)發(fā)人用預(yù)防性腫瘤疫苗提供了科研依據(jù)。
　　 在小鼠模型和臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)熱休克蛋白gp96作為免疫佐劑能夠結(jié)合抗原，并通過(guò)抗原交叉呈遞激活抗腫瘤和感染性疾病的T細(xì)胞反應(yīng)。gp96進(jìn)入抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)部是gp96介導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)至關(guān)重要的一步。本實(shí)驗(yàn)闡明了增強(qiáng)gp96進(jìn)入抗原呈遞細(xì)胞的能力和激活T細(xì)胞的方法。研究結(jié)果表明將TAT多肽與

10、gp96融合能夠降低大腸桿菌表達(dá)的gp96的聚集，顯著地增強(qiáng)gp96進(jìn)入巨噬細(xì)胞的能力。來(lái)源于乙肝病毒主要的抗原（表面抗原，核心抗原和聚合酶）三種已知的Kd限制性的表位肽HBc87-95，HBs362-371和HBV pol140-148作為抗原肽，單獨(dú)免疫或者與rTAT-gp96，rgp96共同免疫HBV轉(zhuǎn)基因小鼠三次。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rTAT-gp96作為佐劑能夠有效地激活HBc87-95，HBs362-371和HBVpol

11、140-148表位肽特異性的T細(xì)胞反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞激活的標(biāo)志CD69的結(jié)果顯示與 rgp96-多肽復(fù)合物免疫相比，rTAT-gp96-多肽復(fù)合物免疫的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD69+CD8+和CD69+CD4+T細(xì)胞的比例顯著地增加。IFN-γ細(xì)胞內(nèi)染色結(jié)果表明與rgp96-多肽復(fù)合物免疫相比，rTAT-gp96-多肽復(fù)合物免疫的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ的CD8+和分泌IFN-γ的CD4+T細(xì)胞的比例也顯著地增加了。殺傷實(shí)

12、驗(yàn)結(jié)果表明rTAT-gp96-多肽復(fù)合物免疫顯著地增加HBc87-95，HBs362-371，和HBV pol140-148表位肽特異性的CTLs的細(xì)胞毒性。rTAT-gp96-多肽復(fù)合物免疫HBV轉(zhuǎn)基因小鼠能夠顯著的降低血清中的乙肝病毒的DNA拷貝數(shù)，血清中表面抗原的水平以及肝臟細(xì)胞中乙肝病毒核心抗原的水平。此外，在小鼠B16-F10黑色素腫瘤模型中，TAT多肽顯著地增強(qiáng)了gp96疫苗的抗腫瘤活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為有效的增強(qiáng)gp96進(jìn)入抗