抗仔豬腹瀉多價(jià)腸毒素及菌毛復(fù)合疫苗的研制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、仔豬腹瀉(diarrhea)是當(dāng)前國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)面臨的一大難題,每年因此造成的經(jīng)濟(jì)損失非常巨大。導(dǎo)致仔豬腹瀉的主要致病菌是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenic Escherichiacoli,ETEC),其致病過程依賴菌毛黏附素和腸毒素的共同作用。目前,防治仔豬腹瀉最有效方法就是疫苗預(yù)防,但是傳統(tǒng)ETEC疫苗的開發(fā)和應(yīng)用還存在著很多缺陷和不足,其中疫苗使用的地區(qū)限制性、實(shí)效性、安全性問題首當(dāng)其沖。本研究將菌毛和腸毒素兩個(gè)致病因

2、子都作為疫苗抗原,涵蓋導(dǎo)致腹瀉腸毒素類型以及主要菌毛類型,對腹瀉發(fā)病的各個(gè)環(huán)節(jié)都進(jìn)行保護(hù),保證了疫苗的廣泛適用性和高效性;同時(shí)本研究采用基因重組技術(shù)將幾種腸毒素蛋白融合,而且去除了腸毒素毒力保留并增強(qiáng)免疫原性,避免了全菌抗原使用時(shí)帶來的安全風(fēng)險(xiǎn)。
  本研究首先對大連得勝地區(qū)豬場的腹瀉情況進(jìn)行調(diào)研,分別采用麥康凱平板法以及PCR方法篩選并分析導(dǎo)致腹瀉的致病菌類型。采用腸毒素LTB和STb基因引物進(jìn)行PCR檢測的結(jié)果顯示,腹瀉便樣中

3、分離得到的大腸桿菌確定為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌,而且全部菌株都分泌STb耐熱性腸毒素、大部分菌株分泌不耐熱性腸毒素LTB;采用F4、F5、F6、F41菌毛基因引物PCR檢測的結(jié)果顯示,本地區(qū)豬場中ETEC的菌毛類型全部為F41,其他菌毛基因檢測結(jié)果為陰性。
  在提取制備疫苗所需的重組三價(jià)腸毒素蛋白和菌毛蛋白的過程中,本研究對重組腸毒素蛋白的提取純化方法進(jìn)行了優(yōu)化,并且探索了菌毛高效表達(dá)的方法。首先,針對重組三價(jià)腸毒素蛋白的提純,本研究

4、使用了稀釋-透析-超濾離心多重去除變性劑的方法,使目的蛋白的純度由11.2%提高到接近100%,同時(shí)目的蛋白在提純過程中損失較少,產(chǎn)率也隨之提高;隨后在提取菌毛蛋白的研究過程中,對比了改良Minca培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基中菌毛蛋白的表達(dá)量,SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示改良Minca培養(yǎng)基中菌毛蛋白的表達(dá)量要高于其他兩種培養(yǎng)基。
  本研究制備了重組三價(jià)腸毒素及菌毛多價(jià)復(fù)合疫苗、重組腸毒素疫苗、菌毛疫苗、豬場滅活全菌苗

5、,采用小鼠和成年豬進(jìn)行疫苗的安全性試驗(yàn)后,對妊娠母豬進(jìn)行免疫,以期考察疫苗的免疫效力。仔豬被動免疫結(jié)果顯示,經(jīng)過復(fù)合疫苗免疫母豬所產(chǎn)仔豬腹率為2.94%,而未免疫對照組的腹瀉率為29.4%,打分評價(jià)的綜合腹瀉指數(shù)顯示復(fù)合疫苗組仔豬腹瀉程度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照組,各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較均差異極顯著(p<0.01)。間接ELISA試驗(yàn)檢測復(fù)合疫苗組母豬血清和乳清中特異性抗體含量,結(jié)果顯示在一免、二免后血清中特異性抗體效價(jià)持續(xù)上升,抗F4菌毛抗體效價(jià)

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