酶降解膠原凝膠法制備無載體角膜上皮細胞片的實驗研究.pdf

1、目的： 報道一種利用膠原酶降解膠原凝膠制備無載體角膜上皮細胞片的新方法，并研究該細胞片的特性。 方法： 用Ⅰ型膠原制備膠原凝膠，通過稱重法研究膠原凝膠的穩(wěn)定性，并通過質量損失法進行膠原凝膠的降解實驗和膠原酶作用中止實驗，以確定膠原凝膠的降解情況和膠原酶作用中止的時間。在鋪有膠原凝膠的通透性培養(yǎng)皿 Tanswell insert上，用組織塊法培養(yǎng)兔角膜緣上皮細胞，使用氣液界面培養(yǎng)技術促進復層上皮的形成，然后用特異膠

2、原酶降解膠原凝膠，并用膠原酶抑制劑中止酶的作用，制備復層上皮細胞片。HE染色和電鏡觀察細胞片組織形態(tài)，免疫組化觀測其蛋白表達，并通過檢測細胞片不同培養(yǎng)時間下的層數(shù)和活力以確定細胞片的最佳狀態(tài)時間。 結果： 1.用調節(jié)pH法成功制備透明、均勻的膠原凝膠。凝膠在37℃條件下，30天內在PBS溶液中保持穩(wěn)定。 2.降解實驗顯示在0.1mg/ml(45U/ml)膠原酶溶液降解條件下，膠原凝膠在1.5h時完全降解；膠原酶降

3、解膠原的作用在3小時被膠原酶抑制劑胎牛血清和半胱氨酸的混合液中止。通過統(tǒng)計分析計算，在制備細胞片過程中，在膠原酶降解凝膠50分鐘時加入膠原酶抑制劑，可使膠原凝膠在完全降解的時刻，膠原酶的作用也剛好中止。 3.采用組織塊培養(yǎng)法，角膜緣上皮細胞在膠原凝膠上生長良好，具有良好的增殖和分化能力。2-3天細胞從組織塊周圍成片狀爬出；7-9天融合并形成單層，細胞呈圓形、卵圓形，細胞界限清楚，鑲嵌排列呈鋪路石狀，細胞融合成單層后；氣液界面繼續(xù)

4、培養(yǎng)7-9天，形成復層角膜上皮，細胞密集堆積，分不清細胞界限。 4.形成復層細胞片后，用膠原酶降解膠原凝膠，并用PVDF膜轉移，得到完整的無載體角膜上皮細胞片。HE可見細胞片在14天到17天時，細胞片形成4到6層的復層上皮結構：表層細胞呈現(xiàn)扁平狀外觀，中間細胞呈翼狀，底層細胞接近立方狀，與正常兔角膜上皮結構相似。電鏡可見微絨毛、緊密連接和橋粒連接等超微結構，和正常角膜上皮相似。 5.在培養(yǎng)14天到17天之間，角膜上皮細胞

5、片形成4-6層的復層結構，沒有空洞，細胞活力也較好，表明構建的細胞片在14到17天之間狀態(tài)較好。 6.免疫組化可見細胞片表達K3、K14，同時基底膜組分Ⅳ型膠原、層粘連蛋白和整合素β1等在基底細胞表達陽性，緊密連接蛋白組分Occludin以及鈣粘蛋白組分Cadherin也表達陽性。 結論： 利用調節(jié)pH的方法，制備出在培養(yǎng)條件和時間內穩(wěn)定存在的透明均勻的膠原凝膠，并成功地采用組織塊培養(yǎng)法在膠原凝膠上構建出兔復層角