Lenti-EGFP轉(zhuǎn)染離體兔角膜上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察慢病毒(lentivirus)載體用于角膜上皮細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的有效性及安全性。
　　 方法：角膜上皮細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)并應(yīng)用免疫熒光技術(shù)做細(xì)胞鑒定。慢病毒載體介導(dǎo)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(lenti-EGFP)以不同的感染復(fù)數(shù)(MOI=0,1,10,50,100,500)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96h運(yùn)用倒置熒光顯微鏡觀察不同感染復(fù)數(shù)(MOI)下增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)并計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)染率,測定最佳

2、轉(zhuǎn)染劑量,即最適感染復(fù)數(shù)；RT-PCR方法檢測EGFP基因的表達(dá)情況。lenti-EGFP以最適感染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)染角膜上皮細(xì)胞,通過組織化學(xué)技術(shù)(HE染色、透射電子顯微鏡)觀察正常角膜上皮細(xì)胞及轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化；流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測慢病毒載體對(duì)角膜上皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果：EGFP于轉(zhuǎn)染48h即開始有表達(dá),隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長其表達(dá)增強(qiáng)。MOI=1、10、50、100時(shí),角膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染率隨著感染復(fù)數(shù)的增加而增

3、加,各感染復(fù)數(shù)下的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),MOI在100與500時(shí),轉(zhuǎn)染率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),即最適感染復(fù)數(shù)為100。RT-PCR結(jié)果提示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)EGFP基因有明確表達(dá)。當(dāng)MOI=100時(shí),角膜上皮細(xì)胞臟染色提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,與正常角膜細(xì)胞形態(tài)一致；透射電子顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與正常細(xì)胞無明顯差別。流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率與正常組細(xì)胞無明顯差別(P>O.05)。
　　 結(jié)論：