AKAP13在小鼠卵泡發(fā)育中的作用研究.pdf

1、AKAP13也稱作Brx-1，AKAP-Lbc和proto-Lbc，是眾多AKAP蛋白家族成員中的一種。它在多個器官和組織中高表達(dá)，比如脾，胸腺，外周血白細(xì)胞，骨骼肌和睪丸;在胎盤和肺中適度表達(dá);在肝，腦，小腸，結(jié)腸和前列腺癌中沒有或者最低限度的表達(dá)。AKAP13這一組織分布的特點(diǎn)表明，AKAP13基因可能在調(diào)節(jié)免疫、生殖和肌肉骨骼系統(tǒng)活動中起著重要的作用。AKAP13包含有兩個重要的結(jié)構(gòu)域:PKA結(jié)合域和GEF結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞內(nèi)許多信號通

2、路主要是由PKA介導(dǎo)的。因此AKAP13可能通過與PKA結(jié)合將許多信號通路整合起來。AKAP13通過GEF結(jié)構(gòu)域激活小GTP結(jié)合蛋白RhoA在許多生理活動中發(fā)揮著重要的作用。因為RhoA可以控制細(xì)胞的許多生理活動，比如細(xì)胞周期進(jìn)程，基因表達(dá)，肌動蛋白的重構(gòu)和胞質(zhì)的分裂。此外，有研究報道，cAMP依賴性的PKA介導(dǎo)的信號通路參與了FSHR信號通路的傳導(dǎo)。而且現(xiàn)在研究已表明，AKAP13可以增強(qiáng)配體依賴性的雌激素受體α(ERα)、β(ERβ

3、)和糖皮質(zhì)激素受體的活性?？紤]到AKAP13參與多種激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及在糖蛋白激素受體信號通路傳導(dǎo)中可以結(jié)合PKA和激活RhoA等G蛋白活性的重要性，以及影響LHR信號通路的傳導(dǎo)，我們提出假設(shè)，AKAP13可能參與并且會影響小鼠卵泡FSHR信號通路的傳導(dǎo)。
　　 首先我們對AKAP13在卵巢組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。通過對5例正常的人的卵巢組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析，我們發(fā)現(xiàn)，AKAP13主要在人的卵巢黃體，成熟卵泡中的顆粒

4、細(xì)胞和膜細(xì)胞中表達(dá)，而在未成熟的卵泡中不表達(dá)。通過對原代培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞免疫化學(xué)染色和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，AKAP13蛋白在小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中廣泛分布，而且沿著細(xì)胞骨架分布，這說明AKAP13的作用可能與細(xì)胞骨架相關(guān)，這和先前的報道也是一致的。
　　 然后我們利用小鼠卵巢顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)體系，初步研究了AKAP13在成熟小鼠卵巢FSHR信號通路中的作用。研究發(fā)現(xiàn):(1)FSH處理顆粒細(xì)胞48h后與0h比較，可以顯著誘

5、導(dǎo)LHR和Aromatase的mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.04，P=0.02)。對于AKAP13，F(xiàn)SH處理顆粒細(xì)胞48h后與0h比較，差異不顯著，沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.06)，但是仍然存在一個FSH可以誘導(dǎo)AKAP13mRNA表達(dá)的趨勢。(2)與對照組比較，用AKAP13siRNA轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞24h后，可以顯著降低內(nèi)源性AKAP13mRNA水平的表達(dá)，AKAP13的表達(dá)水平為對照組的11％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=

6、0.001)。降調(diào)AKAP13的表達(dá)也會降低Aromatase和LHR基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.03，p=0.005)。(3)在原代培養(yǎng)成熟小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中，使用siRNA降調(diào)AKAP13的表達(dá)后，再給予FSH處理，使得FSH誘導(dǎo)LHRmRNA表達(dá)受損。上述結(jié)果還在未成熟小鼠卵巢顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)實驗中，酚紅指示劑和膠原蛋白是否對FSH誘導(dǎo)LHR表達(dá)等不同條件中得到了驗證。
　　 為了明確AKAP13在體內(nèi)

7、的具體作用，通過同源重組基因打靶技術(shù)，我們將AKAP13基因的GEF結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵序列敲除構(gòu)建了AKAP13基因敲除小鼠模型。AKAP13基因敲除小鼠純合子胚胎因為心臟發(fā)育嚴(yán)重缺陷于E10.5-11天死亡。經(jīng)過對這些純合子胚胎研究發(fā)現(xiàn)，它們在E9-9.5天之前都是能正常發(fā)育的，但是到了E10天以后，與野生型小鼠胚胎比較發(fā)現(xiàn)，純合子胚胎發(fā)育遲緩，前腦尺寸減小，頸部區(qū)域緊縮以及第一腮弓發(fā)育不全。更重要的是，純合子胚胎的心臟發(fā)育異常，表現(xiàn)為心

8、室的擴(kuò)大和心包積液的產(chǎn)生。對AKAP13基因敲除的純合子胚胎HE染色發(fā)現(xiàn)，小鼠的心肌隨著小梁形成的減少而變薄。為了研究小鼠心臟發(fā)育停止作用機(jī)制，我們首先檢測了心臟中一些增殖和凋亡標(biāo)志物的情況。Ki67增殖抗原的染色強(qiáng)度在野生型和AKAP13基因敲除純合子小鼠胚胎中并沒有顯著差異。使用TUNEL在E9-9.5天檢測AKAP13基因敲除純合子胚胎并沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加的情況，符合胚胎發(fā)育停止的情況，但是并不是由于細(xì)胞程序性死亡的增加導(dǎo)致的胚

9、胎發(fā)育停止。通過對野生型和雜合型胚胎免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，AKAP13蛋白主要分布在小鼠的前腦，肢芽，第一腮弓和發(fā)育中的心臟。我們試圖用RT-PCR方法從AKAP13基因敲除純合子小鼠的胚胎中擴(kuò)增AKAP13基因，但是未得到擴(kuò)增產(chǎn)物。這表明突變型基因不能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或突變的mRNA轉(zhuǎn)錄物是不穩(wěn)定的。
　　 由于AKAP13基因敲除小鼠胚胎致死，我們只能通過研究AKAP13基因敲除雜合型小鼠來間接分析AKAP13基因在小鼠卵泡發(fā)育中的作用

10、機(jī)制。為了評估AKAP13基因?qū)τ谛∈笊衬芰Φ挠绊?，我們將野生型的雄性C57BL/6小鼠分別與野生型雌性C57BL/6小鼠和AKAP13基因敲除雜合型雌性小鼠進(jìn)行交配。在共計19窩中，AKAP13基因敲除雜合型雌性小鼠平均產(chǎn)仔率比野生型雌性小鼠少繁殖1.6個幼仔(3.7VS5.3)，但是差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。盡管差異不顯著，但是仍然可以說明，AKAP13基因敲除后小鼠的生殖能力是降低的。
　　 因此，除了已知的FSH可以誘導(dǎo)LH