人卵泡發(fā)育過程中卵泡液蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，許多研究表明卵母細(xì)胞成熟與蛋白質(zhì)合成、磷酸化狀態(tài)的改變密不可分。已證實(shí)與卵子發(fā)育和成熟相關(guān)的調(diào)控物質(zhì)包括StAR(steroidogenic acute regulatory protein)、減數(shù)分裂促進(jìn)因子MPF、成熟刺激因子(MPF)、絲裂原激活蛋白激酶家族(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)、cAMP/蛋白激酶A(cAMP/PKA)等等，但仍有許多未知蛋白和已知蛋白參與調(diào)節(jié)的具體過程尚不清楚，需要

2、進(jìn)一步研究。探索卵母細(xì)胞成熟機(jī)制成為女性生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)能夠識別鑒定細(xì)胞、組織或機(jī)體的全部蛋白質(zhì)，提供了一組蛋白質(zhì)的功能及其模式的信息，能夠同時反映細(xì)胞內(nèi)部的遺傳特性和外界因素的影響的結(jié)果。因此深入研究卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的機(jī)制，客觀上需要在蛋白質(zhì)組的水平進(jìn)行進(jìn)一步的探索。蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳．質(zhì)譜技術(shù)的日趨成熟以及SELDI-TOF-MS技術(shù)的出現(xiàn)使蛋白質(zhì)組學(xué)研究飛速發(fā)展，因?yàn)樗鼜哪軌驈恼w水平上揭示可能參與人類疾病發(fā)生、基因

3、調(diào)控、組織發(fā)生和發(fā)育等等蛋白分子調(diào)控機(jī)制。本研究采用SELDI-TOF-MS以及2-DE兩種技術(shù)，立足于整體，在蛋白質(zhì)組水平上直接研究卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的機(jī)制。 目的: 1．應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)，建立人成熟卵泡液及竇卵泡液的蛋白質(zhì)表達(dá)指紋圖譜，尋找在卵泡生長發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟過程中起關(guān)鍵作用的小分子蛋白質(zhì)。 2．應(yīng)用雙向凝膠電泳．質(zhì)譜技術(shù)，建立人成熟卵泡液及竇卵泡液的蛋白質(zhì)譜，篩選鑒定在卵泡生長發(fā)育及卵

4、母細(xì)胞成熟過程中起關(guān)鍵作用的大分子蛋白質(zhì)。 3．建立未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，研究探討篩選鑒定得到的卵母細(xì)胞成熟相關(guān)蛋白在卵母細(xì)胞成熟過程中的作用。 方法: 1．采用SELDI-TOF-MS技術(shù)和WCX-2蛋白芯片(弱陽離子交換蛋白質(zhì)芯片)檢測48例人成熟卵泡液、21例竇卵泡液中的蛋白質(zhì)組分變化，PBSII-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)自動讀取數(shù)據(jù)，獲得的結(jié)果采用Ciphergen公司的Biomarker，wizard

5、和Biomarker Patterns System軟件進(jìn)行分析。 2．采用雙向凝膠電泳．質(zhì)譜技術(shù)檢測48例人成熟卵泡液、21例竇卵泡液中的蛋白質(zhì)組分變化，比較兩組的蛋白表達(dá)差異，并對差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。 3．以昆明白小鼠未成熟卵母細(xì)胞為研究對象，在體外培養(yǎng)體系中加入不同濃度的轉(zhuǎn)鐵蛋白/載脂蛋白E(篩選鑒定得到的卵母細(xì)胞成熟相關(guān)蛋白)，觀察其對卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)、核成熟以及體外成熟的卵母細(xì)胞的受精率的影響。

6、 結(jié)果: 1．利用SELDI-TOF-MS技術(shù)通過WCX2芯片初步建立了人卵泡發(fā)育成熟過程中的蛋白質(zhì)指紋圖譜，共捕捉到53個蛋白質(zhì)峰(單電荷峰)，進(jìn)行成熟卵泡液與竇卵泡液的成組數(shù)據(jù)均數(shù)比較t檢驗(yàn)，31個蛋白質(zhì)峰在兩組卵泡液中均低表達(dá)，18個蛋白質(zhì)峰高表達(dá)，差異無顯著性；4個蛋白質(zhì)峰表達(dá)存在顯著差異，與竇卵泡液相比，Mr6622.43、Mr7525.63兩種蛋白質(zhì)在成熟卵泡液表達(dá)上調(diào)，Mr2291.65、Mr9131.65兩種蛋

7、白質(zhì)表達(dá)下降。 2．為推測這4種差異蛋白的類別，以測定的質(zhì)/荷比為理論相對分子質(zhì)量，同時按照所用的質(zhì)譜儀的檢測誤差±0.1％設(shè)定相對分子質(zhì)量的誤差，在ExPASy的SWISS-PROT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫利用Tagldent tool根據(jù)分子量在人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中模糊檢索卵泡液蛋白，只有Mr為6622.43的蛋白檢索到的結(jié)果是唯一的蛋白，可能是載脂蛋白C-I亞型前體，其余三種蛋白Mr7525.63、Mr2291.65、Mr9131.65

8、檢索結(jié)果不確定。 3．通過雙向凝膠電泳技術(shù)，獲得了較高分辨率的卵泡液蛋白質(zhì)譜圖，共檢測到180多個蛋白質(zhì)點(diǎn)。根據(jù)ImageMaster軟件分析結(jié)果，并既往文獻(xiàn)報道，選擇了5種成熟卵泡液中表達(dá)顯著增高的、且既往文獻(xiàn)中未作過鑒定的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF分析。蛋白質(zhì)點(diǎn)1是載脂蛋白E(ApoE)，蛋白質(zhì)點(diǎn)5為轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)，而蛋白質(zhì)點(diǎn)2 PRO2044和蛋白質(zhì)點(diǎn)3 Hypotheticalprotein根據(jù)蛋白數(shù)據(jù)庫鑒定

9、分析結(jié)果看，可能是血清白蛋白的修飾產(chǎn)物。蛋白質(zhì)點(diǎn)4鑒定的結(jié)果是IgG heavy chain，僅用MS技術(shù)不足以確定IgG重鏈的具體分型。載脂蛋白E及轉(zhuǎn)鐵蛋白在卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過程中的作用目前未見系統(tǒng)性的研究報道。 4．在昆明系小白鼠未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中加入TRF，與對照組(單純FSH組)相比，高濃度TRF組的卵母細(xì)胞GVBD發(fā)生率和PBI排出率顯著降低；但經(jīng)TRF培養(yǎng)成熟的M Ⅱ期卵母細(xì)胞正常受精率與對照組相比顯著升高

10、，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 5．在昆明系小白鼠未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系中加入AnoE，與對照組(單純FSH組)相比，隨著ApoE的濃度增加，卵母細(xì)胞的GVBD發(fā)生率和PB Ⅰ排出率顯著降低，二者負(fù)相關(guān)；且經(jīng)ApoE培養(yǎng)成熟的M Ⅱ期卵母細(xì)胞正常受精率不隨著ApoE的濃度增加而改變，與對照組相比無顯著差異。 結(jié)論: 1．采用SELDI-TOF-MS以及2-DE兩種蛋白質(zhì)組學(xué)方法，從整體水平上建立了卵泡發(fā)育成熟不同階

11、段的卵泡液蛋白質(zhì)圖譜，發(fā)現(xiàn)在卵泡發(fā)育的不同階段，卵泡液蛋白質(zhì)組分種類基本一致，僅有數(shù)種蛋白質(zhì)在表達(dá)量上存在顯著差異。篩選鑒定了5種差異蛋白，分別是載脂蛋白E(ApoE)、PRO2044、Hypothetical protein、IgG heavy chain及轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)，其中載脂蛋白E及轉(zhuǎn)鐵蛋白在卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過程中的作用目前未見系統(tǒng)性的研究報道。這些蛋白可能在卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，或是卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的標(biāo)志物，

12、為研究卵母細(xì)胞成熟機(jī)制，和今后建立更完善的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系提供了理論依據(jù)。 2．在小鼠未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中加入TRF進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)高濃度TRF抑制體外培養(yǎng)的小鼠卵母細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂。正常生理狀態(tài)下只有FSH受體表達(dá)最多的卵泡才能克服高濃度的TRF阻礙得以發(fā)育，卵母細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂進(jìn)而成熟。因此TRF是卵泡發(fā)育，特別是優(yōu)勢卵泡選擇形成過程的重要局部調(diào)節(jié)因子，并參與卵母細(xì)胞受精過程。 3．ApoE可能通過抑制卵泡