卵泡發(fā)育過程中γ-氨基丁酸作用的初步探討.pdf

1、γ-氨基丁酸是由谷氨酸在谷氨酸脫羧酶的作用下脫羧而成，是中樞抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，分泌GABA的神經(jīng)末梢位于下丘腦的神經(jīng)核及中隆部，而其神經(jīng)細(xì)胞則在下丘腦以外，GABA在下丘腦對黃體生成素和泌乳素有調(diào)節(jié)作用。近年來，人們發(fā)現(xiàn)30多種外周組織中也有GABA的存在，特別是卵巢和輸卵管中含量最高，提示GABA可能對生殖系統(tǒng)有某種生理作用。GABA對哺乳類動物卵巢功能的影響，已引起生殖內(nèi)分泌領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。有資料提示大鼠卵泡的生長與卵巢GABA含量有

2、關(guān)，并且動物實驗提示外源性GABA對黃素化顆粒細(xì)胞分泌雌二醇和孕酮有抑制作用。本實驗利用ELISA及RIA技術(shù)探索GABA與人卵泡發(fā)育及卵子成熟的關(guān)系和外源性GABA對人黃素化顆粒細(xì)胞分泌功能的影響。 第一部分人卵泡液中GABA濃度與卵泡成熟的相關(guān)性研究 研究目的：探討在人的卵泡發(fā)育過程中GABA濃度與卵泡發(fā)育及卵子成熟的關(guān)系。 材料和方法： 1標(biāo)本來源 來自2007.10～2007.12于南方醫(yī)

3、院生殖中心行IVF/ICSI-ET的患者44例，患者月經(jīng)周期規(guī)律，年齡均小于35歲，不孕原因均為輸卵管因素不孕或男性因素不孕?；颊卟捎肎nRH長方案，陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育，監(jiān)測過程中收集未成熟卵泡的穿刺液，無血污。當(dāng)雙側(cè)卵巢中至少有3個卵泡平均直徑≥16mm-17mm時給于HCG5000～10000IU，HCG注射后34～36小時取卵，HCG注射日抽血查E2，取卵日留取成熟卵泡的穿刺液，卵泡液無血染，1個卵泡內(nèi)含1個卵母細(xì)胞，空卵泡除外

4、。將獲得的卵泡液離心，3000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，取上清裝入EP管待測卵泡液中GABA濃度，將標(biāo)本保存在-20℃，避免反復(fù)凍融，保存時間不超過一個月。 2分組 A組成熟卵泡液34例B組未成熟卵泡液10例3統(tǒng)計學(xué)方法利用人γ-氨基丁酸ELISA試劑盒檢測卵泡液中GABA濃度，比較兩組卵泡液中GABA的濃度以探索卵泡發(fā)育過程中GABA的變化。利用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，獨立樣本t檢驗比較兩組濃度的差異。P<0.0

5、5差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： A組與B組卵泡液中GABA的濃度分別為(29.7126±10.4225；7.0420±3.1971)ng/ml，A組濃度明顯高于B組并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 小結(jié)： 首次證實了在人卵泡液中存在GABA。成熟卵泡液中GABA濃度(29.7126±10.4225ng/ml)明顯高于未成熟卵泡液中GABA濃度(7.0420±3.1971ng/ml)，兩者有顯著性差異，提示在卵泡發(fā)育過

6、程中GABA有可能參與了卵泡發(fā)育成熟的調(diào)節(jié)。 第二部分GABA對人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞分泌雌二醇與孕酮的影響 研究目的：研究GABA對人離體黃素化顆粒細(xì)胞分泌E2和P的影響。 材料與方法： 1.標(biāo)本來源同第一部分方法 (1)，取卵日留取患者成熟卵泡液離心分離黃素化顆粒細(xì)胞，將分離出的黃素化顆粒細(xì)胞分為5組進行體外培養(yǎng)24小時，換液，換為無血清培養(yǎng)基，加入處理因子，使培養(yǎng)液的終體積為1ml，GABA的

7、終濃度分別為0mol/l；10-8mol/l、10-7mol/l、10-6mol/l、10-5mol/l，繼續(xù)培養(yǎng)24小時留取上清待測。 2.分組 對照組11例10-8mol/l11例10-7mol/l11例10-6mol/l11例10-5mol/l11例3統(tǒng)計學(xué)方法用人雌二醇和孕酮的放免試劑盒檢測上清液中E2和P的濃度，比較各組中激素濃度的變化。利用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用單向方差分析比較處理組與對照組

8、之間激素水平的差異。P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1.顆粒細(xì)胞體外生長情況 顆粒細(xì)胞培養(yǎng)24小時貼壁，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞呈星形生長，細(xì)胞與細(xì)胞之間有絲狀突起相互連接，細(xì)胞核大、圓，胞漿富含顆粒。 2.GABA對顆粒細(xì)胞分泌E2、P的影響 對照組上清液中E2和P濃度分別為27.6132±6.4235pg/ml，47.8203±11.8306ng/ml，加入不同濃度的GABA后，上清液中

9、的E2和P濃度分別為： ①加入10-8mol/lGABA，與對照組相比，兩者差異均有統(tǒng)計學(xué)意義； ②加入10-7mol/lGABA，與對照組相比，兩者差異均有統(tǒng)計學(xué)意義； ③加入10-6mol/lGABA，與對照組相比，兩者差異均有統(tǒng)計學(xué)意義： ④加入10-5mol/lGABA，與對照組相比，兩者差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。 ⑤10-8mol/l、10-7mol/l、10-6mol/l、10-5mol/l

10、GABA對人黃素化顆粒細(xì)胞分泌E2均有抑制作用，但是各組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，GABA對人黃素化顆粒細(xì)胞分泌E2的抑制作用無濃度依賴性。 ⑥10-8mol/l、10-7mol/l、10-6mol/l、10-5mol/lGABA對人黃素化顆粒細(xì)胞分泌P均有抑制作用，但是各組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；GABA對人黃素化顆粒細(xì)胞分泌P的抑制作用無濃度依賴性。 小結(jié)： 1顆粒細(xì)胞體外生長24小時貼壁，細(xì)胞呈星形生長，細(xì)胞

11、與細(xì)胞之間有絲狀突起相互連接，細(xì)胞核大、圓，胞漿富含顆粒，提示顆粒細(xì)胞在體外維持了細(xì)胞生物學(xué)活性； 2本實驗首次證實：①加入不同濃度GABA明顯抑制人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞E2的分泌，E2濃度分別為：(27.6132±6.4235、17.7604±4.5452、14.9253±4.8766、15.7983±3.3625、14.9479±2.7196)pg/ml，GABA對人黃素化顆粒細(xì)胞E2的分泌無濃度依賴性；②加入不同濃度GABA

12、(10-8mol/ml、10-7mol/ml、10-6mol/ml、10-5mol/ml)明顯抑制人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞P的分泌(P<0.05)，P濃度分別為：(47.8203±11.8306、38.8716±6.5662、33.9939±12.6404、30.5186±5.2769、31.0975±5.2056)ng/ml，GABA對人黃素化顆粒細(xì)胞P的分泌無濃度依賴性，提示GABA在卵泡發(fā)育過程中可能參與顆粒細(xì)胞分泌甾體激素的調(diào)節(jié)。

13、 研究目的： 第三部分取卵日人成熟卵泡液中GABA對成熟卵率、受精率和卵裂率的影響研究人成熟卵泡液中GABA濃度對成熟卵率、受精率和卵裂率的影響。 材料與方法： 1.標(biāo)本來源 同第一部分方法(1)，取卵日留取患者成熟卵泡液，卵泡液無血污，并且排除空卵泡。將取卵日獲得的成熟卵泡液離心，3000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，取上清裝入EP管，分別測成熟卵泡液中GABA濃度和E2的濃度。將標(biāo)本保存在-20℃，避免反

14、復(fù)凍融，保存時間不超過一個月。 2.分組記錄HCG日血漿E2濃度和HCG日>14mm的卵泡個數(shù)，然后取平均值，將其分為三組：即E2/follicularA組≤200pg/ml7例B組201～400pg/ml17例C組>400pg/ml12例3統(tǒng)計學(xué)方法用人γ-氨基丁酸ELISA試劑盒檢測卵泡液中GABA濃度和人E2ELISA試劑盒檢測卵泡液中E2濃度。利用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用單向方差分析(One-wayANO

15、VA)用于多組均數(shù)的比較，R×C表資料的x2檢驗用于多組率的比較，采用雙變量相關(guān)分析分析兩個變量之間的相關(guān)關(guān)系。P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1三組患者的成熟卵泡液中GABA濃度和E2濃度的比較 三組患者成熟卵泡液中GABA濃度分別為(54.8714±14.9167、48.4394±16.0094、45.0000±11.4040)ng/ml，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，成熟卵泡液中E2濃度分別為(278.377l

16、±138.3014、439.6418±224.3433、682.1617±227.6842)pmol/l，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 2三組患者的成熟卵率、受精率和卵裂率的比較 ①三組的成熟卵率分別為59.3％、72.8％、89.9％，三組成熟卵率差異有統(tǒng)計學(xué)意義； ②三組的受精率分別為89.1％、88.5％、90.4％，三組受精率差異無統(tǒng)計學(xué)意義； ③三組的卵裂率分別為82.8％(53、64)、82.0％、80

17、.0％，三組卵裂率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 3成熟卵率、受精率、卵裂率與成熟卵泡液中GABA及E2濃度的關(guān)系 ①成熟卵率與成熟卵泡液中E2的關(guān)系：經(jīng)相關(guān)分析，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.409，P=0.013，即認(rèn)為在IVF-ET周期中成熟卵率與卵泡液中E2濃度呈正相關(guān)關(guān)系。 ②經(jīng)相關(guān)分析，成熟卵率、受精率、卵裂率與成熟卵泡液中GABA濃度無相關(guān)關(guān)系；受精率、卵裂率與成熟卵泡液中E2濃度無相關(guān)關(guān)系。 小結(jié)：