重組鈣網(wǎng)蛋白150-230片段的原核表達(dá)、純化及免疫學(xué)功能研究.pdf

1、鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+結(jié)合蛋白，其可以作為分子伴侶，幫助新生多肽鏈進(jìn)行正確折疊，以及參與 MHCⅠ類分子/抗原肽復(fù)合物的形成等過(guò)程。CRT全長(zhǎng)416個(gè)氨基酸，由N-domain，P-domain，C-domain三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。N-domain是一個(gè)凝集素樣的球形結(jié)構(gòu)域，能夠與具有特定結(jié)構(gòu)的多糖結(jié)合。P-domain和C-domain可以結(jié)合Ca2+，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)具有重要作用。CRT

2、的N端的信號(hào)肽以及C末端的KDEL序列，使其能夠?qū)虿Ⅰv留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。但近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，CRT還能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外發(fā)揮重要的免疫生物學(xué)功能。CRT能夠以膜形型式出現(xiàn)在細(xì)胞表面，參與凋亡細(xì)胞清除以及抗腫瘤免疫應(yīng)答。CRT還能夠以可溶性的形式出現(xiàn)在自身免疫病患者的血清以及關(guān)節(jié)液等體液中，提示其可能參與自身免疫應(yīng)答過(guò)程。
　　我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，重組表達(dá)的小鼠CRT片段39-272（recombinant CRT/39-272，r

3、CRT/39-272）具有較強(qiáng)的免疫生物學(xué)活性，能夠直接激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞以及B細(xì)胞。rCRT/39-272具有很強(qiáng)的免疫原性，免疫小鼠能夠誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生。rCRT/39-272還具有免疫佐劑效應(yīng)，用融合表達(dá)的rCRT-EGFP蛋白免疫小鼠能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生增強(qiáng)的針對(duì)EGFP的體液免疫應(yīng)答。rCRT/39-272與rCRT全長(zhǎng)蛋白相比，兩者對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的免疫刺激活性相似，提示CRT/39-272是CRT的主要功能活性片段

4、。在此研究的基礎(chǔ)上，本課題對(duì)rCRT發(fā)揮免疫學(xué)活性的更小功能片段進(jìn)行了深入研究。
　　我們利用分子生物學(xué)方法對(duì)CRT/39-272片段進(jìn)一步縮小，分別構(gòu)建了攜帶不同CRT片段的原核表達(dá)載體，并且利用大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行了原核表達(dá)與親和純化。結(jié)果顯示，rCRT/150-230是保留CRT的免疫生物學(xué)活性的最小功能片段。rCRT/150-230具有良好的可溶性，能夠在溶液中以多聚體的形式存在。rCRT/150-230能夠有效激活小鼠腹腔