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文檔簡介
1、鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin,CRT)是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的保守蛋白,具有三個結(jié)構(gòu)域N-domain,P-domain和C-domain。其中N-domain為凝集素結(jié)合序列,輔助新合成蛋白的正確折疊;P-domain和C-domain具有超強的結(jié)合Ca2+能力,可以維持細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài),參與Ca2+介導(dǎo)的信號通路。
隨著CRT研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)CRT可定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外。許多細胞表面都可以檢測到CRT的表達,CRT通過與L
2、DL受體相關(guān)蛋白(LRP)結(jié)合錨定在細胞表面,發(fā)揮其免疫相關(guān)的生物學(xué)功能。此外,CRT還可被分泌至細胞外,成為可溶性(soluble CRT,sCRT)。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)23.3%的RA和21.9%的SLE病人血清中可檢測到sCRT,而健康人血清中sCRT均在檢測限以下,這一結(jié)論也得到其他課題組的驗證。自身免疫病患者血清中檢測到CRT特異性抗體的報道也頗為常見,提示sCRT可能具有免疫原性。原核重組表達的CRT片段rCRT/39-2
3、72具有超強的免疫刺激活性,表現(xiàn)為在低劑量下可刺激小鼠腹腔巨噬細胞分泌細胞因子TNF-α、IL-6,并具有超強的免疫佐劑效應(yīng)等。由此推論,血清sCRT濃度與RA等自身免疫性疾病密切相關(guān),而且可能是一個提示自身免疫病病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。
真核表達體系比原核表達體系有更為完善的蛋白折疊及翻譯后修飾,可以更好地呈現(xiàn)天然蛋白的功能。本課題通過構(gòu)建CRT的真核表達載體,并表達純化得到真核重組CRT(eukaryocyte CRT,e
4、CRT),并將其與原核重組CRT(recombinant CRT,rCRT)對比發(fā)現(xiàn)rCRT主要以多聚體形式存在,eCRT僅以單體形式存在。與rCRT的超強免疫刺激活性相比,eCRT的激活作用則大為遜色。進一步分析理化性質(zhì)與CRT功能的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)脫糖基化的eCRT(tun-eCRT)與eCRT相比,刺激活性增強十倍左右,并且多聚體形式的原核重組rCRT(OrCRT)發(fā)揮主要的免疫刺激活性,而單體形式的原核重組rCRT(MrCRT)的免疫
5、刺激活性與eCRT相仿。
對rCRT激活巨噬細胞的機理進一步探索發(fā)現(xiàn)rCRT刺激巨噬細胞可促進巨噬細胞對rCRT的內(nèi)吞并定位于溶酶體,受體阻斷實驗證明內(nèi)吞作用依賴于清道夫受體A?;蛩窖芯堪l(fā)現(xiàn)MrCRT及OrCRT均可促進TNF-α及IL-6 mRNA的轉(zhuǎn)錄,但不影響mRNA的穩(wěn)定性。TNF-α以及IL-6共同轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制劑可完全抑制CRT刺激的TNF-α及IL-6的轉(zhuǎn)錄,并且低劑量的OrCRT可有效促進IkBa
6、的降解及NF-kB的磷酸化,MrCRT的刺激作用相之較弱。OrCRT可持續(xù)激活MAPK家族三個激酶的磷酸化,但抑制劑阻斷實驗證明CRT刺激巨噬細胞釋放TNF-α依賴于JNK的激活,釋放IL-6是JNK、ERK共同介導(dǎo)的。此外,OrCRT和MrCRT均可抑制Ca2+-ATP酶的活性,使胞內(nèi)鈣離子濃度升高,從而誘導(dǎo)UPR的效應(yīng)分子GRP78/Bip水平升高,啟動下游信號通路的激活,進而激活JNK以及NF-kB,增強靶基因TNF-α、IL-6
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