雞IL-18的原核表達(dá)蛋白及真核表達(dá)質(zhì)粒對IBD疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究.pdf

1、白細(xì)胞介素18(IL-18)具有廣泛的生物學(xué)活性，能夠促進(jìn)γ-干擾素(IFN-γ)的產(chǎn)生，刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，在介導(dǎo)細(xì)胞免疫、抵抗微生物感染方面具有重要的作用。對人和哺乳動物IL-18的研究已有許多報(bào)道。本研究室在2001年開展雞白細(xì)胞介素18(ChIL-18)的研究，先后構(gòu)建ChIL-18的重組質(zhì)粒和原核表達(dá)系統(tǒng)、真核質(zhì)粒及其表達(dá)系統(tǒng)，在此基礎(chǔ)上，對純化后的原核表達(dá)的重組雞白細(xì)胞介素18產(chǎn)物進(jìn)行生物學(xué)活性檢測，對

2、其在生產(chǎn)中的應(yīng)用做了初步研究，同時(shí)對影響ChIL-18原核表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性的因素也進(jìn)行了探討。 試驗(yàn)一不同復(fù)性方法對rChIL-18原核表達(dá)蛋白復(fù)性率和生物學(xué)活性的影響 研究利用不同的復(fù)性方法輔助rChIL-18原核表達(dá)蛋白的復(fù)性，以提高雞IL-18重組蛋白復(fù)性率，獲得更多具有良好活性的蛋白。將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-mChIL-18轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞大腸桿菌BL21(DE3)，并用IPTG于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)

3、物主要以包涵體的形式存在。包涵體經(jīng)超聲波破碎、洗滌后以6mol/L的鹽酸胍溶解，使蛋白徹底變性，然后利用鹽酸胍-去離子水透析法、鹽酸胍-谷胱甘肽變性復(fù)性法和人工分子伴侶系統(tǒng)法分別輔助蛋白復(fù)性。復(fù)性產(chǎn)物經(jīng)透析純化后，利用淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)來檢測其活性。經(jīng)SDS-PAGE分析表明，表達(dá)產(chǎn)物是與ChIL-18重組蛋白相符的Mr約44000的蛋白條帶。利用人工分子伴侶系統(tǒng)輔助復(fù)性的方法獲得的復(fù)性率最高，復(fù)性率為42.54％。雞淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明

4、，表達(dá)產(chǎn)物對雞淋巴細(xì)胞具有明顯誘導(dǎo)增殖作用。由上述試驗(yàn)顯示，人工分子伴侶系統(tǒng)能夠較好地輔助雞IL-18重組蛋白復(fù)性，獲得較高的復(fù)性率。其產(chǎn)物具有良好的生物學(xué)活性，為下一步雞IL-18重組蛋白的應(yīng)用研究奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。 試驗(yàn)二人工分子伴侶系統(tǒng)輔助雞IL-18重組蛋白復(fù)性過程中影響因素的研究 將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-mChIL-18轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞大腸桿菌BL21(DE3)，并用IPTG于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得表達(dá)。表達(dá)的包涵體

5、經(jīng)超聲波破碎、洗滌后以6mol/L的鹽酸胍溶解，使蛋白徹底變性。然后按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察不同濃度組成的人工分子伴侶體系對不同濃度雞IL-18重組蛋白復(fù)性率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，利用人工分子伴侶系統(tǒng)輔助雞IL-18重組蛋白的復(fù)性存在最佳的條件，優(yōu)化該條件能夠提高該融合蛋白的復(fù)性率，且產(chǎn)物都具有良好的生物學(xué)活性，為雞IL-18重組蛋白的進(jìn)一步應(yīng)用研究奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。 試驗(yàn)三雞IL-18原核表達(dá)蛋白及真核表達(dá)質(zhì)粒對IBDV滅活疫苗免疫增

6、強(qiáng)作用的研究 將雞IL-18原核表達(dá)蛋白的復(fù)性產(chǎn)物和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1TOPO-mCh1L18分別與IBDV滅活疫苗聯(lián)合應(yīng)用，通過中和抗體檢測和T淋巴細(xì)胞對ConA增殖反應(yīng)試驗(yàn)，研究其對IBDV滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用。結(jié)果顯示，在接種后第21、28、35及42d時(shí)蛋白組和質(zhì)粒組與單純疫苗組抗體水平差異顯著(P＜0.05)，且蛋白組比質(zhì)粒組效果更明顯一些；其T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)也強(qiáng)于單純疫苗組，尤其是在免疫14天后增殖效

7、果明顯高于單純疫苗組(P＜0.05)。接種42d后進(jìn)行攻毒保護(hù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明：同時(shí)接種雞IL-18原核表達(dá)蛋白復(fù)性產(chǎn)物和真核表達(dá)質(zhì)粒的試驗(yàn)組雞獲得93.3％的保護(hù)率，而單純疫苗接種組的保護(hù)率為73.3％。雞IL-18的原核表達(dá)蛋白和真核表達(dá)質(zhì)粒均具有明顯的增強(qiáng)IBD滅活疫苗免疫效果的作用。 結(jié)論： 人工分子伴侶系統(tǒng)能夠較好地輔助雞IL-18重組蛋白復(fù)性，獲得較高的復(fù)性率。其產(chǎn)物具有良好的生物學(xué)活性，為下一步雞IL-18