豬SP-D檢測(cè)和真核表達(dá)及其對(duì)弓形蟲(chóng)基因疫苗免疫增強(qiáng)效應(yīng)研究.pdf

1、表面活性蛋白D(SP-D)屬于膠原凝集素家族成員，是黏膜上皮細(xì)胞分泌的一個(gè)模式識(shí)別蛋白，其在機(jī)體對(duì)各種病原體的先天免疫反應(yīng)中具有重要的作用。
　　大量研究已表明，SP-D可作為多種疾病的生物標(biāo)記物。為了提高對(duì)SP-D表達(dá)水平的檢測(cè)效率，本研究建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR和金納米PCR方法。本研究根據(jù)豬SP-D mRNA基因序列(nm_214110)設(shè)計(jì)并合成引物和TaqMan探針，PCR擴(kuò)增得到豬SP-D基因CDS區(qū)序列，并連接pMD

2、-18T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒PMD-SP-D作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。試驗(yàn)優(yōu)化了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件，建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=-3.131X+35.09，擴(kuò)增效率達(dá)108％，R2達(dá)到0.999，CT值的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于3％。標(biāo)準(zhǔn)CT值與模板的初始濃度呈良好的線性關(guān)系，可以檢測(cè)到的最低濃度為3copies/μL。在這項(xiàng)研究中還建立了金納米PCR方法，在優(yōu)化的反應(yīng)條件下進(jìn)行其特異性，靈敏度檢測(cè)。結(jié)果表明，金納米PCR方法能擴(kuò)增出與實(shí)驗(yàn)

3、設(shè)計(jì)相一致的特異條帶，其敏感性與特異性均優(yōu)于普通PCR。應(yīng)用金納米PCR方法檢測(cè)豬胸膜肺炎外周血清樣品，結(jié)果表明金納米PCR方法可用于臨床檢測(cè)。
　　在建立檢測(cè)方法的同時(shí)本研究構(gòu)建了含SP-D全基因序列的重組質(zhì)粒PMD-SP-D,以此為模板，以具有限制性酶切位點(diǎn)SalⅠ，HindⅢ的特異性引物PCR擴(kuò)增了SP-D基因，PCR產(chǎn)物克隆至SalⅠ/HindⅢ酶切線性化的載體pFastBac HTb，通過(guò)酶切位點(diǎn)和測(cè)序鑒定該重組質(zhì)粒構(gòu)建

4、成功。將重組載體pFastBac HTb轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)，進(jìn)行X-gal篩選和PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明，成功擴(kuò)增豬SP-D基因，并構(gòu)建了克隆載體pFastBac SP-D,重組載體轉(zhuǎn)化成功轉(zhuǎn)化后得到重組Bac-SP-D表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后成功表達(dá)重組SP-D蛋白。經(jīng)純化后得到純度較高的重組SP-D蛋白，采用SP-D ELISA試劑盒分析結(jié)果顯示，以桿狀病毒為載體的重組SP-D蛋白具有生物活性。該部分實(shí)驗(yàn)建立了體外表達(dá)具有生

5、物活性的豬SP-D的方法，為研究其在豬體免疫調(diào)節(jié)中的作用和在疫苗及藥物的應(yīng)用開(kāi)發(fā)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　多年來(lái)，T.gondii基因疫苗已成為T.gondii疫苗研究的熱點(diǎn)，但其免疫效率低。研究發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)機(jī)體固有免疫穩(wěn)態(tài)和記憶T細(xì)胞中SP-D與細(xì)胞因子發(fā)揮了關(guān)鍵作用，為驗(yàn)證SP-D與核酸疫苗共同免疫是否可以提高其療效，在已驗(yàn)證重組SP-D蛋白具有生物活性的基礎(chǔ)上，本研究以表達(dá)T.gondii頂端膜抗原1(AMA1)的DNA疫苗PcD

6、NA3.1-AMA1免疫小鼠，采用MTT試驗(yàn)和血清抗體檢測(cè)對(duì)在基因疫苗佐劑PcDNA3.1-SP-D存在或缺乏狀況下的免疫反應(yīng)進(jìn)行了分析。間接免疫熒光法(IFA)和免疫熒光共聚焦激光掃描顯微鏡(LSCFM)表明，SP-D可以在體外細(xì)胞中表達(dá)，且外源蛋白被分散在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)。采用MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，相對(duì)PcDNA3.1-AMA1組，PcDNA3.1-SP-D+ PcDNA3.1-AMA1組淋巴細(xì)胞被誘導(dǎo)的增殖胞反應(yīng)更顯著(P＜0.05)。

7、AMAI抗體檢測(cè)表明，PcDNA3.1-SP-D+ PcDNA3.1-AMA1組AMA1抗體水平增長(zhǎng)顯著(P＜0.001)。該試驗(yàn)結(jié)果表明了PcDNA3.1-SP-D在T.gondii基因疫苗免疫中的基因佐劑作用，為T.gondii疫苗免疫及治療效率提高提供了可行方案，為進(jìn)一步研究預(yù)防和治療Toxoplasmosis奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究對(duì)微量SP-D mRNA檢測(cè)提供了兩種高效的檢測(cè)方法，為推廣SP-D mRNA作為疾病生物標(biāo)

8、記物的檢測(cè)和金納米粒子PCR的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)體外表達(dá)了具有生物活性的豬SP-D的方法，重組蛋白可以用于研究其在豬體免疫調(diào)節(jié)中的作用，對(duì)重組SP-D蛋白在疫苗和藥物的應(yīng)用開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。本研究首次構(gòu)建了PcDNA3.1-SP-D DNA疫苗，并驗(yàn)證了PcDNA3.1-SP-D在T.gondii基因疫苗免疫中的基因佐劑作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了SP-D的免疫增強(qiáng)作用，同時(shí)為T.gondii疫苗免疫及治療效率提高提供了可行方案，為進(jìn)一步研究