雞白細(xì)胞介素18重組質(zhì)粒的胚胎接種對(duì)IBDV DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究.pdf

1、白細(xì)胞介素18(Interleukin-18. IL-18)是由單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，在結(jié)構(gòu)上屬于IL-1家族，功能上與IL-12相似，且二者有協(xié)同效應(yīng)。除了能夠明顯誘導(dǎo)Th1, NK, NKT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ外，IL-18還可誘導(dǎo)諸如IL-2, GM-CSF及TNF-α等其它多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞的活性，上調(diào)細(xì)胞毒作用，促進(jìn)T細(xì)胞增殖，在誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的分化成熟過(guò)程和Th1細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫

2、反應(yīng)中具有促進(jìn)和調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)室在2002年開展雞白細(xì)胞介素18(ChIL-18)的研究，先后構(gòu)建ChIL-18的原核表達(dá)質(zhì)粒、真核表達(dá)質(zhì)粒，在此基礎(chǔ)上，對(duì)真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-ChIL-18表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行生物學(xué)活性評(píng)價(jià)，并將其作為免疫佐劑進(jìn)行了初步研究。本論文主要對(duì)真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-ChIL-18的胚胎接種進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，確認(rèn)了該真核表達(dá)質(zhì)粒的胚胎接種效果，并用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測(cè)法對(duì)pCI-ChIL-1

3、8質(zhì)粒在試驗(yàn)雞的血液、脾臟和法氏囊中的動(dòng)態(tài)進(jìn)行了跟蹤;同時(shí)，對(duì)胚胎接種pCI-ChIL-18增強(qiáng)IBDV DNA疫苗的增強(qiáng)效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
　　 通過(guò)對(duì)孵化率、平均囊指數(shù)、脾指數(shù)、外周血淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和白介素18蛋白水平表達(dá)的檢測(cè)，評(píng)定了重組雞真核表達(dá)質(zhì)粒(pCI-ChIL-18)胚胎接種的不同接種劑量和接種方法的效果。結(jié)果表明，pCI-ChIL-18質(zhì)粒接種18胚齡雞胚不影響孵化率，對(duì)雞的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)影響，不同的接種途徑和接種

4、劑量對(duì)雞體內(nèi)ChIL-18的表達(dá)有影響。與1日齡雛雞肌肉接種比較，胚胎接種可明顯促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞的早期增殖，而且呈劑量依賴，但相同接種途徑的200μg接種組與300μg接種組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。提示pCI-ChIL-18接種18胚齡雞胚是安全的，200μg尿囊腔接種是最佳方案。
　　 以常規(guī)PCR產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)品，分別通過(guò)熔解曲線和瓊脂糖凝膠電泳分析檢測(cè)特異性，對(duì)各PCR產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋后作為模板進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，建立了

5、基于SYBR GreenⅠ染料技術(shù)的ChIL-18基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR方法。利用已建立的方法對(duì)胚胎接種pCI-ChIL-18雞不同時(shí)間點(diǎn)質(zhì)粒的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，建立的PCR具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速等特點(diǎn)。試驗(yàn)組雞在pCI-ChIL-18質(zhì)粒經(jīng)胚胎尿囊腔接種后，孵出時(shí)((0h)血液中就能檢測(cè)到高濃度ChIL-I8的存在(2.05×106 copies/μl)，后隨著試驗(yàn)雞日齡的增加，血液中ChIL-18的濃度隨之下降。提示

6、胚胎接種pCI-ChIL-18使ChIL-18在雞血液中早期持續(xù)高濃度存在，有利于機(jī)體早期免疫應(yīng)答能力的增強(qiáng)。
　　 以雞GAPDH基因的核苷酸序列，建立了基于SYBR Green I染料技術(shù)的雞GAPDH基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR方法。利用建立的檢測(cè)方法結(jié)合ChIL-18基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)雞白細(xì)胞介素18在脾臟和法氏囊中基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在孵出后0h～22d，試驗(yàn)組雞只脾臟中ChIL-18基因表達(dá)水平明顯

7、高于對(duì)照組;試驗(yàn)雞在孵出時(shí)(0 h)，法氏囊中ChIL-18基因的表達(dá)水平(3.10×104copies/106 cells)就顯著高于空白組(P<0.05)，后緩慢下降，至18d時(shí)和對(duì)照組無(wú)顯著差異(P﹥0.05)。提示胚胎接種pCI-ChIL-18重組質(zhì)粒，可促進(jìn)雞脾臟和法氏囊中pCI-ChIL-18基因的早期大量表達(dá)，有利于機(jī)體早期免疫應(yīng)答能力的增強(qiáng)。
　　 為進(jìn)一步評(píng)價(jià)胚胎接種pCI-ChIL-18的免疫佐劑作用，用pC

8、I-ChIL-18與傳染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分別免疫18胚齡SPF雞胚，設(shè)1日齡雛雞肌肉免疫對(duì)照組和空白對(duì)照組，2周齡時(shí)二免，6周齡時(shí)用IBDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株BC6/85攻擊。研究表明，胚胎免疫pCI-ChIL-18能顯著促進(jìn)試驗(yàn)雞T、B淋巴細(xì)胞的早期增殖反應(yīng)，增強(qiáng)IBDV多聚蛋白DNA疫苗誘導(dǎo)的早期抗體水平。胚胎免疫pCI-ChIL-18對(duì)IBDV多聚蛋白DNA疫苗的早期免疫效果具有顯著的增強(qiáng)作用((p﹤0.05)