TnGV ENHANCIN原核表達(dá)產(chǎn)物功能驗(yàn)證及真核表達(dá).pdf

1、增效蛋白(Enhancin)是一類主要由昆蟲(chóng)桿狀病毒基因編碼金屬蛋白酶，分子量大小約89～110KDa，它通過(guò)破壞昆蟲(chóng)中腸圍食膜的完整結(jié)構(gòu)，加速病毒粒子的侵入，從而提高生物殺蟲(chóng)劑對(duì)害蟲(chóng)的感染效率。
　　 為了尋找和確定增效蛋白在昆蟲(chóng)中腸圍食膜上的靶標(biāo)蛋白和進(jìn)一步揭示Enhancin蛋白的增效機(jī)制，本研究設(shè)計(jì)如下：以粉紋夜蛾顆粒體病毒(TnGV)的增效蛋白Tn-En為研究對(duì)象，體外擴(kuò)增獲得目的基因，并進(jìn)行原核表達(dá)。通過(guò)SDS-PA

2、GE、Western blot和Ni+親和層析驗(yàn)證目的蛋白。利用初步純化的增效蛋白進(jìn)行生物測(cè)定，并提取棉鈴蟲(chóng)5齡幼蟲(chóng)的圍食膜進(jìn)行增體外酶解實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建重組桿狀病毒真核表達(dá)載體：Bacmid-pFastBac-En和含有報(bào)道基因EGFP的真核表達(dá)載體Bacmid-pFastBac-En-EGFP，轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9，實(shí)現(xiàn)目的基因的真核表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE和Western blot技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 Tn-En基因的原核表達(dá)成

3、功，生物測(cè)定結(jié)果顯示3VE可以提高死亡率23.34％，4VE提高死亡率22.22％，5VE提高死亡率1.67％。體外降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)圍食膜上某種大分子量的蛋白可以被增效蛋白降解。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Bacmid-pFastBac-En-EGFP的細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光存在，電泳及雜交證明融合蛋白真核表達(dá)成功，為非分泌型蛋白。重組基因Bacmid-pFastBac-En經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示在真核系統(tǒng)中表達(dá)成功。