HCoV-NL63 N蛋白不同片段的原核表達(dá)純化及血清學(xué)檢測應(yīng)用分析.pdf

1、背景：
　　 冠狀病毒是一類單股正鏈RNA病毒[1]，屬于冠狀病毒科的冠狀病毒屬，基因組長度約為27-33kb，是RNA病毒中基因組最長的一類呼吸道病毒[2]。根據(jù)病毒的血清學(xué)特點(diǎn)和核苷酸序列的差異，分為三組[3]：第一第二組主要感染哺乳動(dòng)物，第三組僅感染禽類。人類冠狀病毒229E、OC43是普通感冒的主要病原體之一。2003年，一種以引起嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(severeacuterespiratorysyndrom，SARS)

2、[4]為臨床表現(xiàn)的新型冠狀病毒的爆發(fā)流行及其高致病性和高致死率引起了全世界的重新關(guān)注，隨后對(duì)于冠狀病毒的不斷深入研究，相繼又發(fā)現(xiàn)兩種新的人類冠狀病毒HCoV-NL63[5，6]和HCoV-HKU1[7]，而現(xiàn)有研究懷疑冠狀病毒可能存在未發(fā)現(xiàn)的毒株或新變異毒株，因此針對(duì)冠狀病毒的深入研究依然具有重大的公共衛(wèi)生意義。SARS的危害性，引起無數(shù)研究者的深入關(guān)注，而對(duì)目前已知的除SARS-CoV之外的其他四種冠狀病毒免疫學(xué)特征的研究，對(duì)防治SA

3、RS-CoV的再次蔓延及新型毒株的診斷、防控及治療有重大意義。
　　 研究目的:
　　 應(yīng)用原核表達(dá)載體，對(duì)HCoV-NL63核衣殼蛋白N端(1-163aa)、C端(141-306aa)基因片段進(jìn)行原核表達(dá)，制備相應(yīng)的非融合蛋白Np、Cp及融合純化蛋白Np-SA、Cp-SA，建立WBLA方法比較HCoV-NL63全長核衣殼蛋白Nf、核衣殼蛋白N端(Np)、C端(Cp)在血清學(xué)檢測中的差別，從而建立特異、靈敏、簡易并可推廣

4、應(yīng)用的HCoV-NL63血清學(xué)檢測方法與試劑。
　　 方法與結(jié)果:
　　 本研究采用pET30-a(+)原核表達(dá)系統(tǒng)，在不改變讀碼框情況下，我們利用合適的酶切位點(diǎn)將六個(gè)HIS加入目的基因羧基端，分別構(gòu)建了攜帶有HCoV-NL63N蛋白N端(1-163aa)，C端(141-306aa)基因片段的表達(dá)質(zhì)粒pET30a-Np、pET30a-Cp、pET30a-Np-SA、pET30a-Cp-SA，將其轉(zhuǎn)化于BL21(DE3)感

5、受態(tài)細(xì)胞，通過優(yōu)化IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件使得Np、Cp兩種HIS標(biāo)簽蛋白均得到了可溶性表達(dá)，兩種融合蛋白均以包涵體的形式存在。Westernblot驗(yàn)證目的蛋白與抗HIS抗體結(jié)合情況，結(jié)果表明四種蛋白均得到了正確表達(dá)。
　　 原核表達(dá)系統(tǒng)大量表達(dá)目的蛋白后我們通過鎳離子金屬螫合層析純化的方法得到了純度達(dá)95％以上的HIS標(biāo)簽蛋白，應(yīng)用Westernblot驗(yàn)證純化蛋白與HCoV-NL63感染者陽性血清特異性結(jié)合情

6、況，結(jié)果顯示人類冠狀病毒NL63N蛋白N端、C端均與HCoV-NL63陽性血清有特異性結(jié)合，證明表達(dá)的蛋白具有生物活性。
　　 我們采用WBLA(Westernblotlineassay)方法利用純化的兩種非融合蛋白Np、Cp及全長N蛋白平行篩查了50份體檢血清中抗體存在情況及三種蛋白在血清學(xué)檢測中的差異，Westernblot結(jié)果顯示：HCoV-NL63人群普遍感染，50份體檢血清中，N全長蛋白(Nf)、N端(Np)、C端(C

7、p)分別檢出25、27、36份抗體陽性血清，檢出率分別為50％、54％、72％。N全長蛋白、N端一致率64％，N全長蛋白、C端一致率54％，N端、C端一致率54％。
　　 總結(jié)：
　　 本研究成功構(gòu)建了HCoV-NL63N蛋白N端和C端及其與鏈親和素融合基因的原核表達(dá)質(zhì)粒并得到了相應(yīng)的純化蛋白，Westernblot結(jié)果顯示四種蛋白均得到了正確表達(dá)。應(yīng)用非融合純化蛋白Np、Cp檢出陽性血清，WBLA結(jié)果顯示HCoV-NL