傳染性造血器官壞死病毒糖蛋白的原核表達及其免疫學(xué)鑒定.pdf

1、魚類傳染性造血器官壞死?。↖nfectious hematopietic necrosis，IHN）是一種由傳染性造血器官壞死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)引起的嚴重危害鮭鱒魚類的主要疾病之一。受發(fā)病魚的種類及大小、毒株及環(huán)境因素的影響，IHN可造成魚苗近100％的死亡率。至今IHNV已經(jīng)擴散至美洲、歐洲、澳洲及亞洲的十余個國家。自上世紀九十年代，我國虹鱒魚主產(chǎn)區(qū)多次遭遇

2、到IHN的困擾，虹鱒魚產(chǎn)量急劇下降，嚴重阻礙了我國冷水性魚養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。因此，傳染性造血器官壞死病的診斷和防治日益引起人類的重視。
　　IHNV囊膜表面有一個糖蛋白(Glycoprotein，G)突起。G蛋白在參與細胞受體與病毒的識別和結(jié)合等過程中起著非常重要的作用，并且與病毒的毒力相關(guān)。此外，G蛋白還是病毒的主要抗原，存在保護性抗原決定簇，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性中和抗體。因此，G蛋白及其抗體的制備在IHNV診斷試劑的開

3、發(fā)、G蛋白功能的研究及基因工程疫苗的研制中具有重要的作用。
　　我國現(xiàn)行IHNV毒株與歐關(guān)等國家的IHNV流行毒株基因型均有所不同，有可能會導(dǎo)致G蛋白免疫原性改變。因此，針對我國IHNV毒株的免疫學(xué)檢測方法的建立極為必要。而目前，以全長G蛋白為抗原制備的多抗與病毒性出血性敗血癥病毒(Viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV)存在交叉反應(yīng)。針對上述問題，本研究在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，對我國現(xiàn)

4、行IHNV毒株G蛋白進行截短表達和抗血清的制備，旨在建立我國現(xiàn)行IHNV的免疫學(xué)檢測方法。
　　本研究以本實驗室分離保存的IHNV-Sn1203(GenBank accession no.KC660147)分離株基因組RNA提取物為模板，利用RT-PCR一步法擴增截短的G蛋白部分基因序列(375 bp)（命名為short G）。將其插入到表達載體pET-27b中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-27b-IHNV-short G，通過大腸桿

5、菌Rosetta表達菌株獲得高效表達。在IPTG濃度為1 mM時，37℃誘導(dǎo)表達4h時目的蛋白表達量最大，SDS-PAGE電泳分析顯示目的蛋白約為13 kDa，符合預(yù)期大小，以包涵體的形式表達。利用8M的尿素進行蛋白變性，2M的尿素復(fù)性處理后獲得高純度的不帶任何標簽的純化蛋白，利用該蛋白制備兔抗血清。ELISA結(jié)果顯示，該兔抗血清與重組蛋白的反應(yīng)效價為1∶80000，說明制備的兔抗血清能夠識別表達的重組蛋白，該重組蛋白具有良好的免疫原性

6、;該兔抗血清與IHNV的反應(yīng)效價為1∶40000，該結(jié)果表明重組short G蛋白能正確折疊，具有與天然表面蛋白相當(dāng)?shù)拿庖咴?間接免疫熒光結(jié)果表明兔抗G蛋白血清具有良好的特異性，與VHSV參考毒株沒有任何交叉反應(yīng)。
　　上述結(jié)果表明本研究所制備的short G蛋白具有較好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。本研究通過對G蛋白進行截短表達消除了ELISA檢測IHNV時與VHSV存在交叉反應(yīng)的問題，提高了IHNV免疫學(xué)檢測的特異性，完善了IHN