傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）ORF092R的克隆、表達(dá)分析及細(xì)胞定位.pdf

1、傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)是造成養(yǎng)殖鱖暴發(fā)性死亡的主要病原，屬于虹彩病毒科腫大細(xì)胞病毒屬。ISKNV是腫大細(xì)胞病毒屬中首個(gè)全基因組序列被測(cè)定的病毒。 ISKNV基因組中ORF092R長(zhǎng)276bp，編碼一個(gè)91個(gè)氨基酸，分子量為10369.02道爾頓的蛋白。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)該蛋白是定位于線粒體的單次跨膜蛋白。為了研究其基因功能，根據(jù)ISKNV的基因組序列，設(shè)計(jì)和制作了基于寡聚核苷酸探針的基因芯片，并檢測(cè)了ISKNV感染鱖后不同

2、感染時(shí)間段脾臟中ORF092R的轉(zhuǎn)錄情況，再結(jié)合半定量RT-PCR結(jié)果，得到ORF092R在ISKNV增殖過(guò)程中不同時(shí)段的時(shí)相表達(dá)譜。 為了進(jìn)一步研究ORF092R，通過(guò)基于RNA連接酶的cDNA末端快速擴(kuò)增(RNAligasemediatedrapidamplificationofcDNAend，RLM-RACE)技術(shù)成功獲取了其5'端cDNA序列，確定了ORF092R的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于基因組的84394bp。通過(guò)PCR擴(kuò)增O

3、RF092R后，克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N3上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FHM(fatheadminnow)細(xì)胞后通過(guò)激光共聚焦倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)病毒蛋白092(virusprotein092，VP092)與GFP(greenfluorescentprotein)的融合蛋白在線粒體膜附近的區(qū)域有較多的聚集。Western免疫印跡檢測(cè)也確定了VP092主要存在于細(xì)胞的線粒體粗提組分中?；谀さ鞍椎奶攸c(diǎn)，選用pET載體高效表達(dá)了兩次重復(fù)的VP09